浙江省科技计划项目(2008C22058)
- 作品数：6 被引量：67H指数：4
- 相关作者：徐洋郝贵杰潘晓艺沈锦玉尹文林更多>>
- 相关机构：浙江省淡水水产研究所中国水产科学研究院浙江大学更多>>
- 发文基金：浙江省科技计划项目湖州市科技计划项目国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 嗜水气单胞菌TPS-30株丝氨酸蛋白酶基因与溶血素基因在大肠杆菌中的融合表达被引量：11
- 2010年
- 嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶和溶血素是该菌重要的致病因子与保护性抗原。致病性嗜水气单胞菌TPS-30株为江浙一带鱼类暴发病病原主要血清型O:9的代表株。研究利用PCR方法扩增嗜水气单胞菌TPS-30株的丝氨酸蛋白酶基因(Spe)和溶血素基因(Hly),将基因Spe和Hly通过柔性片段进行融合,并将融合片段插入pET32a的多克隆位点,构建成重组融合表达载体pET32a-Spe-Hly。将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙醛-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得融合蛋白Spe-Hly。表达产物经SDS-PAGE检测,显示与预期大小约130kD相吻合的融合蛋白带。纯化融合蛋白并对鲫鱼进行免疫攻毒试验。结果表明,丝氨酸蛋白酶基因和溶血素基因融合表达载体构建成功,并成功获得了融合蛋白Spe-Hly,对鲫鱼的免疫保护率达81.4%。这为基因工程亚单位多价疫苗的开发提供基础。
- 潘晓艺郝贵杰姚嘉赟徐洋尹文林沈锦玉
- 关键词：嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶基因溶血素基因
- 嗜水气单胞菌黏附素基因克隆、序列分析及表达被引量：2
- 2010年
- 利用PCR方法对江浙一带淡水鱼类暴发病病原致病性嗜水气单胞菌主要血清型O:9和O:97代表菌株TPS-30和BSK-10的黏附素基因(Al)进行扩增,并分析不同血清型和不同来源菌株Al的序列差异.结果表明:嗜水气单胞菌TPS-30株与BSK-10株相比较,Al序列在N端有个突变区,TPS-30株的Al基因突变区较BSK-10株短;通过pET28a(+)载体构建TPS-30株黏附素基因的表达载体pET28a-AHal,转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,通过SDS-PAGE分析,显示与预期大小约41ku相吻合的融合蛋白带,诱导6h后目的蛋白获得了高效表达,表达量占菌体总蛋白的44.0%;通过免疫攻毒试验发现,免疫银鲫后血清效价在第5周达到峰值,重组表达的蛋白对同源菌株TPS-30和异源菌株BSK-10都具有较高的免疫保护率,分别达到94.7%和77.8%.这为基因工程亚单位疫苗的开发奠定了基础.
- 潘晓艺沈锦玉郝贵杰姚嘉赟徐洋
- 关键词：嗜水气单胞菌免疫原性保护性抗原血清型
- 气单胞菌和嗜水气单胞菌双重PCR检测方法的建立被引量：4
- 2011年
- 针对GenBank中登录的气单胞菌属(Aeromonas)的毒力基因甘油磷脂胆固醇酰基转移酶基因(GCAT)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的16SrRNA基因的保守区设计2对特异性引物。通过进行双重PCR反应体系优化,PCR产物的测序鉴定和特异性试验,建立了一种能同时检测气单胞菌(Aeromonasspp.)和嗜水气单胞菌的双重PCR检测方法。用此方法对5株嗜水气单胞菌、7株其他不同种的气单胞菌和5株非气单胞菌属菌株进行双重PCR检测。结果显示,气单胞菌和嗜水气单胞菌在GCAT基因的扩增区都能得到有效扩增,其中嗜水气单胞菌能同时在16SrRNA基因扩增区得到有效扩增,而非气单胞菌属的菌株,在此两扩增区都为阴性,表明此检测方法可靠且可行。
- 潘晓艺沈锦玉郝贵杰姚嘉贇徐洋尹文林孙逢明吴颖蕾
- 关键词：气单胞菌嗜水气单胞菌双重PCR
- 青虾“软壳综合症”病原及其特性被引量：36
- 2009年
- 从患软壳综合症的濒死青虾体内分离到一株细菌QXL0711B,经人工感染试验,其对青虾的半数致死浓度(LC50)为1.47×106CFU/mL,具有较强毒力。API32E系统鉴定及16SrRNA序列分析,该病原菌为维罗纳气单胞菌温和生物变种(Aeromonas veronii biovar sobria,登录号:FJ808727)。其系统发育分析表明,菌株QXL0711B与维罗纳气单胞菌(登录号:X71120)和维罗纳气单胞菌温和生物变种(登录号:AY987729)的亲缘关系最近,其同源性都为99%。药敏实验结果表明:菌必治、复达欣、环丙沙星、恩诺沙星、氟哌酸等5种化学疗剂对该病原菌有较强的抑菌作用。
- 潘晓艺沈锦玉李建应贺宝祥尹文林郝贵杰徐洋姚嘉赟
- 关键词：青虾日本沼虾
- 中华鳖爱德华菌病病原菌的分离鉴定及致病因子研究被引量：15
- 2010年
- 采用API 20E系列生化鉴定及16S rDNA和gyrB基因序列同源性分析方法,对从患病中华鳖(Trionyx sinen-sis)肝脏中分离到的一株细菌TL5m进行了鉴定,并通过人工感染试验,对该菌株进行了毒力检测;此外分别提取该TL5m株的主要致病因子外膜蛋白、脂多糖和胞外产物,对中华鳖进行毒力和免疫保护率试验。结果显示:菌株TL5m的API 20E鉴定编码为4544000,99.9%为迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda);其16SrDNA序列和gyrB基因序列(GenBank登录号分别:EF121756和GU563803)与迟钝爱德华氏菌的同源性最高(分别为94%和98%);菌株TL5m对中华鳖的半数致死量LD50为2.45×106 CFU/ind。药敏感结果显示菌株对磷霉素、菌必治、头孢孟多、头孢噻吩、壮观霉素高度敏感。外膜蛋白攻毒剂量60μg/ind和脂多糖攻毒剂量400μg/ind时,对中华鳖的致死率都为33.3%,胞外产物对中华鳖的LD50为31.73μg/ind;全菌灭活苗、胞外产物、外膜蛋白和脂多糖的免疫保护率分别为75%、62.5%、25%和87.5%。结果表明,发病中华鳖的病原菌为迟钝爱德华氏菌,其分泌的胞外产物对中华鳖具有较高毒力;提取的脂多糖对中华鳖遭受迟钝爱德华氏菌攻击具有较高免疫保护率。
- 潘晓艺郝贵杰姚嘉赟徐洋沈锦玉尹文林
- 关键词：致病因子
- 致病性维罗纳气单胞菌检测方法的建立被引量：4
- 2011年
- 发掘维罗纳气单胞菌特异性更强的检测靶点和毒力相关基因靶点,建立能够检测致病性维罗纳气单胞菌的PCR检测方法。通过序列比对分析气单胞菌的16S rRNA基因序列,筛选对维罗纳气单胞菌特异的引物,用于检测种特异性,利用气单胞菌气溶素基因保守引物,检测菌株的致病性,并进行反应条件和反应体系的优化,灵敏度试验和特异性试验。发掘并设计的维罗纳气单胞菌16S rRNA特异性引物结合气单胞菌气溶素基因保守引物建立的检测方法,对12株气单胞菌和10株非气单胞菌的检测结果显示,所有致病性维罗纳气单胞菌都能扩增到大小分别为343 bp和232 bp的特异性条带,而非维罗纳气单胞菌的致病性气单胞菌只能扩增到232 bp的气溶素基因特异性条带,其它菌株都不能扩增到目的条带。灵敏度试验表明,该反应体系的检测灵敏度为1.35×10-3 mg/L。我们建立的致病性维罗纳气单胞菌检测方法能特异地检测致病性维罗纳气单胞菌,并具有高度灵敏性。
- 潘晓艺蔺凌云袁雪梅尹文林郝贵杰徐洋姚嘉赟沈锦玉
- 关键词：RRNA双重PCR
