黑龙江省发展高新技术产业专项资金(FW05B007)
- 作品数：15 被引量：17H指数：3
- 相关作者：周建华沈荣显王雪峰孔宪刚相文华更多>>
- 相关机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所内蒙古农业大学东北农业大学更多>>
- 发文基金：黑龙江省发展高新技术产业专项资金哈尔滨市科技攻关计划项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 马传染性贫血病毒囊膜基因gp90 V4区糖基化回复突变感染性克隆的构建
- 2009年
- 为了阐明我国马传染性贫血病毒(EIAV)弱毒疫苗致弱及免疫保护的分子机制,本研究分析了疫苗株及其亲本强毒株共34个囊膜基因序列。结果发现疫苗株在膜基因gp90V4区潜在的N-连接糖基化位点出现了稳定的碱基替换,使该位点消失。为研究囊膜糖基化的作用,以疫苗株全长感染性克隆pLGFD3-8为亲本,利用反向遗传技术对该突变位点进行了糖基化序列回复突变操作,构建了全基因感染性克隆pLGFDg9。将其转染驴胎皮肤细胞(FDD),通过用逆转录酶活性、间接免疫荧光和RT-PCR方法检测而确定其感染性。结果表明,在FDD细胞中盲传3代后,在细胞培养物中可检测到逆转录酶活性,RT-PCR和间接免疫荧光检测均呈阳性,电镜下见到典型的EIAV颗粒。
- 韩秀娥张萍王雪峰孔宪刚周建华相文华
- 关键词：马传染性贫血病毒定点突变感染性克隆
- 马传染性贫血病毒受体基因的原核表达被引量：1
- 2008年
- 为了构建马传染性贫血病毒受体(ELR1)的原核表达体系,克隆ELR1的编码区基因,将其亚克隆到PET-30a构建重组表达质粒PET-30a-ELR1,经酶切和DNA测序鉴定,将阳性质粒转化E.coliBL21感受态细胞,IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE电泳及Westhern-blot分析鉴定,结果表明:该基因在大肠杆菌中以包涵体形式表达,其表观分子质量约为39.6ku;利用尿素洗涤纯化可以得到具有较高纯度的表达蛋白,是一种理想的免疫原。
- 张淑琴罗军荣刘霄卉杨旭艳马学恩周建华
- 关键词：EIAV原核表达
- 5匹马外周血单个核细胞表达MHC-I类分子的差异分析被引量：2
- 2007年
- 基于RT-PCR方法，扩增了用于马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus，EIAV）减毒疫苗株CTL表位研究的5匹马的编码经典MHC—I类分子的大部分基因，具体包括编码肽结合区大部分区域、α3区、穿膜区及胞浆区蛋白的基因，并进行了PCR产物的克隆和测序。试验马匹外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的总RNA提取物经RT-PCR扩增，并将所得产物进行T-A克隆。从每匹马的所有克隆中，分别随机挑取鉴定为阳性重组质粒的21～23个克隆用于测序分析。研究结果表明，5匹试验马匹各自具有3～5个等位基因，由于MHC-Ⅰ分子等位基因表达的共显性特征，可以推测马的基因组内可能存在2～3个基因座对应于这些等位基因，这与国外已有研究结论基本一致。另外，不同马匹PBMC表达的MHC-Ⅰ类分子的差别水平不一致。除了6号与7号和10号马之间MHC-Ⅰ类分子的差异较大，无相同或高度相近的经典MHC-Ⅰ类分子序列外，各马匹间均表达具有1个或1个以上的相同或高度同源的对应经典的MHC-Ⅰ类分子的mRNA。以上研究结果既可作为正在开展的EIAV减毒疫苗株CTL表位研究的基础性、支持性数据，又可进一步丰富国内马的经典MHC-Ⅰ分子多态性方面的相关研究。
- 马建郭巍沈楠孔宪刚沈荣显周建华
- 关键词：多态性
- SSCP和HMA方法在马MHC-I类分子基因多态性研究中的应用被引量：4
- 2008年
- 文章使用SSCP和HMA两种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对马MHC-I类分子基因多态性进行了分析。在应用SSCP法进行分析时,尽管经过实验条件优化,仍未得到对MHC-I基因理想的分离效果,提示该方法对分离多态性较高的基因有一定局限性。在对HMA法用参考标准DNA对影响DNA分子构象的温度和变性剂浓度等实验条件进行优化后,获得了对马MHC-I类分子基因较好的分离效果。6、7、8、9和10号马的样本在相对应泳道上分别出现了6、5、6、5和7个条带。从凝胶中进行DNA条带回收后克隆测序的结果表明,这一方法可以有效地分离高度多态性的MHC-I类分子基因。
- 项伟马建王雪峰赵玉军周建华
- 关键词：SSCPHMA基因多态性
- 马传染性贫血发病过程中细胞毒性T细胞的作用及其表位研究进展
- 2007年
- 马建孔宪刚沈荣显周建华
- 关键词：马传染性贫血病毒细胞毒性发病过程猴免疫缺陷病毒EIAV
- 中国株EIAV S2基因逆向突变感染性克隆的构建及体外感染性评价被引量：3
- 2009年
- 以中国株EIAV的驴强毒株EIAVDV115与疫苗株EIAVFDDV15的S2基因变化规律为依据,利用反向遗传技术对EIAV弱毒疫苗株全基因组感染性克隆pFDDV3-8的S2基因区进行逆向突变,构建了含有强毒株EIAVDV115S2基因区内4个稳定点突变的克隆质粒pFDDVS2r1-3-4-5,将该质粒转染FDD后进行体外继代盲传,经RT-PCR、逆转录酶活性、间接免疫荧光等检测后,显示经EIAV克隆质粒pFDDVS2r1-3-4-5转染的FDD盲传3代后,可在转染的FDD细胞培养物的上清液中检测到EIAV逆转录酶活性;该细胞培养物经RT-PCR和间接免疫荧光检测均呈EIAV阳性;在电镜下可观察到典型EIAV粒子。证明已成功拯救经EIAVS2基因逆向突变后的衍生病毒vpFDDVS2r1-3-4-5。比较vpFDDVS2r1-3-4-5衍生病毒与亲本克隆衍生病毒的复制动力学,表明前者的复制比后者略滞后。以上结果提示,对疫苗株S2基因的突变未明显影响EIAV的体外复制。
- 高旭姜成刚韩秀娥赵立平沈荣显相文华周建华
- 关键词：马传染性贫血病毒S2基因感染性克隆
- 免疫抑制对EIAV弱毒疫苗免疫马体内疫苗弱毒株载量的影响被引量：4
- 2008年
- 为了研究马传染性贫血弱毒疫苗EIAVFDDV在体内的生物学特性,特别是在免疫马血浆中低拷贝存在状态的形成原因,使用连续给予地塞米松的方法,对EIAVFDDV免疫马匹进行了免疫功能抑制.连续给药10天后,以植物血凝素(PHA)作为刺激原的淋巴细胞非特异性增殖实验表明,实验马匹的免疫系统功能受到了明显抑制.使用实时RT-PCR对免疫抑制前后实验马匹体内EIAVFDDV的载量进行了定量检测.结果显示,EIAVFDDV免疫马匹体内的病毒载量在2匹马中未见升高,1匹马体内略有增高,但仍处于EIAVFDDV在免疫马匹体内载量的正常范围.作为对照,强毒株隐性携带马的病毒载量提高了约25000倍,并出现了典型的临床症状.实验结果提示,致弱后病毒特有的生物学特性,而非免疫压力,是EIAV疫苗株在宿主血浆中低拷贝存在的主要原因.同时,在免疫系统功能受抑制状态下,疫苗株在免疫马体内仍然表现出了相对稳定的低拷贝复制状态,进一步显示了EIAVFDDV在应用中的安全性.
- 马建姜成刚林跃智郭亮郭巍孔宪刚沈荣显邵一鸣张哓燕周建华
- 关键词：减毒疫苗免疫抑制病毒载量
- 马传染性贫血病毒受体插入型基因的原核表达
- 2009年
- 采用PCR方法扩增出马传染性贫血病毒受体(EIAVR1)插入型(INR)的基因,将INR基因分别亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-30a中,经PCR和双酶切鉴定以及序列测定,构建其并将其转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中进行表达。结果显示,在pET-30a-INR的表达量高于pGEX-INR,且经过优化表达条件,只在pET-30a-INR以部分可溶蛋白的形式表达,而pGEX-INR仍以包涵体形式表达;经Western blot检测,不同载体表达的蛋白均可被相应的小鼠单克隆抗体特异性识别,具有良好的抗原性。
- 杨旭艳张淑琴王雪峰曹贵方周建华
- 关键词：马传染性贫血病毒原核表达
- T细胞IFN-γ表达水平检测方法的建立及其在马传染性贫血病毒疫苗免疫机理研究中的应用
- 建立准确、有效地检测马传染性贫血病毒(EIAV)感染马不同 T 细胞亚型表达 IFN-γ水平的方法,是探讨 IFN-γ表达水平与疫苗免疫保护的关系的基础。分离的 EIAV 疫苗株免疫马和强毒株感染马的 PBMC 经体外培...
- 林跃智邓喜林沈楠赵立平马建孟庆来郭巍王君伟周建华
- 关键词：IFN-Γ马传染性贫血病毒流式细胞法
- 文献传递
- T淋巴细胞增殖CFSE测定法的建立及其在马传染性贫血病毒疫苗免疫机理研究中的应用
- 利用荧光染料 CFSE 在细胞分裂时,可平均分配到两个子代细胞中的特性,建立流式细胞法检测马传染性贫血病毒(EIAV)抗原特异性 T 细胞增殖水平的方法。
- 林跃智邓喜林沈楠吕晓玲孟庆来郭巍王宇红周建华
- 关键词：CFSE马传染性贫血病毒
- 文献传递
