国家科技部农业科技成果转化资金(2010GB23260591)
- 作品数：3 被引量：16H指数：3
- 相关作者：周志刚张美超曹雅男姚斌白东清更多>>
- 相关机构：中国农业科学院饲料研究所天津农学院更多>>
- 发文基金：国家科技部农业科技成果转化资金中国博士后科学基金天津市农业科技成果转化与推广项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学轻工技术与工程化学工程更多>>
- 淬灭酶AiiO-AIO6酶学性质及对嗜水气单胞菌毒力因子的表达调控被引量：10
- 2011年
- 将N-乙酰高丝氨酸内酯酶基因(aiiO-AIO6)插入表达载体pET28a构建了原核表达载体pET28a/aiiO-AIO6。转化大肠杆菌后筛选具有活性的重组子并对纯化的目的蛋白AiiO-AIO6的酶学性质进行了研究,同时研究了纯化的酶液对嗜水气单胞菌ATCC7966溶血素(Hemolysin,Hem)、细胞肠毒素(Cytotonic enterotoxin,Ast)、胞外蛋白酶(Extracellular protease,Ep)、丝氨酸蛋白酶(Serine protease,Sp)及磷脂酶Pho(Phospholipase A1,Pho)等5个毒力因子表达的影响。结果表明,pET28a/aiiO-AIO6在大肠杆菌中大量表达N-乙酰高丝氨酸内酯酶,纯化后的N-乙酰高丝氨酸内酯酶的最适作用条件为pH 8.0,30℃,在pH 6.0～11.0的范围内能够稳定的存在,在80℃条件下保温30 min后酶活力能够维持在65%以上;且该酶对多种金属离子、化合物和中性蛋白酶都具有很好的抗性;该酶对多种底物都具有一定的降解作用;以3-oxo-C8-HSL为底物时的Km值为0.015 mmol/L;比活力为583.33 U/mg。N-乙酰高丝氨酸内酯酶在培养8 h及12 h时对嗜水气单胞菌5个毒力因子的表达量都具有明显的下调趋势(P<0.05)。本实验通过测定AiiO-AIO6的酶学性质及证明AiiO-AIO6可以通过降解嗜水气单胞菌产生的信号分子来抑制其毒力因子的表达,从而为将其应用于水产环境及致病性嗜水气单胞菌的生物防治奠定理论基础。
- 张美超曹雅男姚斌白东清周志刚
- 关键词：原核表达嗜水气单胞菌
- 高效表达N-乙酰高丝氨酸内酯酶-木聚糖酶融合蛋白及其酶学性质被引量：6
- 2011年
- 【目的】构建N-乙酰高丝氨酸内酯酶-木聚糖酶双酶活性表达毕氏酵母重组菌株,并对经纯化的重组蛋白SL2B进行N-乙酰高丝氨酸内酯酶及木聚糖酶酶学性质的研究。【方法】利用PCR拼接技术得到N-乙酰高丝氨酸内酯酶基因aiiA-B546和木聚糖酶基因xynAS27cd融合而成的基因Sl2b。构建重组表达载体pPIC9/Sl2b转化毕氏酵母,筛选得到同时具有木聚糖酶和N-乙酰高丝氨酸内酯酶活性的重组子,随后对经硫酸铵沉淀、分子筛纯化后得到的重组蛋白SL2B进行N-乙酰高丝氨酸内酯酶及木聚糖酶酶学性质的研究。【结果】筛选得到N-乙酰高丝氨酸内酯酶和木聚糖酶均可高效表达活性的毕氏酵母重组菌株。纯化后的融合蛋白中N-乙酰高丝氨酸内酯酶的最适作用pH为8.0,作用温度为30℃,在pH 6-11的范围内能够稳定的存在,在0℃-50℃之间,酶活性能够维持在80%以上,且该酶对多种金属离子、化合物和中性蛋白酶都具有很好的抗性。该融合蛋白对多种底物都具有一定的降解作用,以3-oxo-C8-HSL为底物时的Km值为0.05 mmol/L。木聚糖酶的最适pH为6.5,最适作用温度为60℃,在pH 6-8的范围内能够稳定的存在,在50℃-65℃之间,酶活性能够维持在80%以上,且该酶对多种金属离子、化合物和中性蛋白酶都具有很好的抗性,以燕麦木聚糖为底物时的Km值为2.9 mg/L。在30℃、中性条件下融合蛋白对动物(鱼)肠道环境具有很好的抗性。【结论】本实验选取的木聚糖酶基因具有一个强启动子,可高效表达,通过融合表达的方式带动N-乙酰高丝氨酸内酯酶的高效表达;木聚糖酶具有易检测的优点,通过融合表达简便N-乙酰高丝氨酸内酯酶的活性检测;同时构建的融合蛋白SL2B中木聚糖酶及N-乙酰高丝氨酸内酯酶性质与单酶相比不受影响,在控制外源性病原菌毒性效应及缓解饲源性抗营养因子危害、维护畜禽(水产)消化道健康方面�
- 张美超曹雅男姚斌周志刚
- 关键词：木聚糖酶酶学性质
- 高丝氨酸内酯酶AI-96对嗜水气单胞菌NJ-1浸浴攻毒斑马鱼保护效应的研究被引量：3
- 2013年
- 为评价斑马鱼口服高丝氨酸内脂酶AI-96对嗜水气单胞菌NJ-1浸浴攻毒的保护效应,实验设置基础料与实验料两组饲料,实验料是在基础料中按3 U/g饲料添加N酰基高丝氨酸内酯酶AI-96(以下简称AI-96),通过高浓度(2.5×108cfu/mL)及低浓度(0.7×108cfu/mL)两组剂量的嗜水气单胞菌NJ-1(以下简称NJ-1)分别浸浴攻毒斑马鱼,在12 h、24 h、3 d、7 d和14 d取鳃丝、肠道壁、肝和肾样,采用实时荧光定量PCR法检测取样器官中NJ-1量,并统计攻毒周期内的死亡率,来评价高丝氨酸内酯酶AI-96的保护力。结果显示:在攻毒周期内所取组织内均检测到NJ-1,按菌数肠>鳃>肝>肾,其中高NJ-1剂量未加酶组各组织NJ-1数量均分别明显高于低剂量处理组。在高剂量攻毒条件下,加酶组各组织NJ-1数量均显著低于未加酶处理组(P<0.05),鳃除外;在低剂量攻毒条件下,未加酶组的NJ-1数量在鳃(3 d)、肠(0.5、1、3、7及14 d)、肝(3 d)和肾(7 d)显著高于加酶组(P<0.05),其余差异不显著(P>0.05)。此外无论在高、低剂量攻毒条件下,加酶组的死亡率均低于未加酶组,其中低剂量攻毒7 d及以后其死亡率显著低于对照(P<0.05)。结果表明,口服AI-96可以有效预防NJ-1≤0.7×108cfu/mL范围内的侵袭。
- 何夙旭张美超徐俐杨雅麟李青周志刚
- 关键词：嗜水气单胞菌实时荧光定量PCR
