国家自然科学基金(30800518)
- 作品数：6 被引量：6H指数：2
- 相关作者：刘霆彭杰张桂英陈选民冷爱民更多>>
- 相关机构：中南大学安化县人民医院绍兴市人民医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家教育部博士点基金长沙市科技计划项目更多>>
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- 肝细胞癌新型靶向基因治疗体系的构建及应用研究被引量：2
- 2012年
- 构建肝细胞癌(HCC)新型靶向基因治疗体系,并以存活素(survivin)基因为靶点,探讨该体系体外杀伤肝癌细胞的作用。构建由巨细胞病毒(CMV)增强子和甲胎蛋白(AFP)启动子构成的融合启动子(AV)驱动的pcD-NA3.1(-)AV质粒,及含绿色荧光蛋白(GFP)的pcDNA3.1(-)AVGFP和含siRNA-survivin的pcDNA3.1(-)AV-siRNA-survivin质粒,以磷酸钙纳米为载体,导入HepG2、SMMC-7721和Hela细胞中,观察转染效率及体外对肝癌细胞的杀伤效应,并采用流式细胞技术(FCM)检测细胞凋亡率。结果显示:AV启动子可特异性驱动下游基因在HepG2细胞表达。此外,pcDNA3.1(-)AVsiRNA-survivin在HepG2细胞中可有效沉默survivin的mRNA和蛋白表达,并诱导68.8%的细胞死亡,而在Hela和SMMC-7721细胞中无显著作用。生长曲线结果显示,转染了pcD-NA3.1(-)AVsiRNA-survivin的HepG2细胞的生长显著受抑(P<0.05)。结果表明,该新型靶向基因治疗体系可高选择性作用于肝癌细胞,可为临床肝癌的基因治疗提供新的研究思路。
- 张鸽文刘霆王志明
- 关键词：肝细胞癌基因治疗甲胎蛋白启动子存活素
- 血管内皮生长因子小干扰核糖核酸联合双自杀基因抗胃癌作用的体外研究
- 2011年
- 目的探讨联合应用靶向血管内皮生长因子（VEGF）小于扰RNA（siRNA）与双自杀基因yCDglyTK对人胃癌细胞的体外杀伤作用。方法以磷酸钙纳米颗粒为载体介导空白质粒pcDNA3．1（-）null（空白质粒组）、靶向VEGF的干扰质粒pGenesil—shVEGF（干扰质粒组）、双自杀基因质粒pcDNA3．1（-）CV-yCDglyTK（双自杀基因组）及联合基因质粒pcDNA3．1（-）shVEGF—yCDglyTK（联合基因组）转染胃癌SGC7901细胞，未转染的胃癌细胞为空白对照组，经G418筛选稳定转染的胃癌细胞株，采用RT—PCR和免疫印迹法验证目的基因表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶（5-FC）后，通过四甲基偶氮唑盐（MTT）生长曲线、旁观者效应实验、Hoechst33258染色及流式细胞术，观察各组细胞的生物学特性变化、凋亡细胞形态及凋亡率。采用SPSS13．0统计学软件进行数据处理分析，组间多重比较采用LSD检验。结果成功建立4种转染不同质粒的胃癌细胞株，联合基因组及双自杀基因组均可检测到双自杀基因yCDglyTK的表达。MTT生长曲线显示5-FC作用24h后，与空白对照组和空白质粒组相比，干扰质粒组、双自杀基因组及联合基因组吸光度值明显降低（P〈0．01）。当稳定转染联合基因的SGC7901细胞占60％、80％和100％时，细胞相对存活率分别为13．09％±2．40％、9．74％±2．83％及5．68％±1．03％。荧光显微镜下见双自杀基因组及联合基因组大量细胞呈现凋亡形态改变。流式细胞检测结果示干扰质粒组、双自杀基因组以及联合基因组的凋亡率分别为16．40％±4．68％、57．63％±4．96％及69．07％±4．69％，与空白对照组相比，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论采用靶向VEGF siRNA与双自杀基因联合治疗可有效杀伤胃癌SGC7901细胞，诱导凋亡是其杀伤瘤细胞的重要机制之一。
- 叶玲张桂英陈选民冷爱民彭杰李新华易红刘霆
- 关键词：基因疗法血管内皮生长因子
- 癌胚抗原相关细胞黏附分子6-shRNA及双自杀基因yCDglyTK的联合基因载体构建被引量：1
- 2011年
- 目的构建新型靶向联合双自杀基因载体pCDNA3.1-yCDglyTK-CEACAM6-shRNA。方法根据已知的癌胚抗原相关细胞黏附分子6(Carcinoembryonic antigen associated cell adhesion molecule 6,CEACAM6)序列构建含有hU6启动子和CEACAM6-shRNA表达框的重组质粒,并将CEACAM6-shRNA表达框(含hU6启动子)通过双酶切方式亚克隆至双自杀基因载体pCDNA3.1-yCDglyTK,构建新型靶向联合双自杀基因载体pCDNA3.1-yCDglyTK-CEACAM6-shRNA。通过酶切、测序等鉴定重组质粒。结果实验所构建的最终载体酶切产物所得的片段大小为7.5 kb,与预期片段一致。测序证实最终载体与pCDNA3.1-yCDg-lyTK-CEACAM6-shRNA序列一致。结论成功构建新型靶向联合双自杀基因载体pCDNA3.1-yCDg-lyTK-CEACAM6-shRNA。
- 龙泓羽彭杰向萍刘霆
- 关键词：RNA干扰自杀基因自杀基因疗法
- shRNA沉默VEGF—C基因对大肠癌淋巴管生成和淋巴结转移的影响
- 2010年
- 目的 观察RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术抑制大肠癌细胞株Lovo中VEGF-C基因的表达,探讨抑制shRNA-VEGF-C对人大肠癌细胞Lovo生物学特性的影响.方法 构建表达ShRNA-VEGF-C重组质粒转染Lovo细胞,72 h后用实时RT-PCR（real-time polymerase chain recation）检测VEGF-C mRNA表达;建立Lovo细胞皮下移植瘤裸鼠模型,注射shRNA-VEGF-C,动态观察肿瘤体积并于4周后处死裸鼠称取瘤重、计算局部淋巴结转移率,免疫组化法检测大肠癌组织微淋巴管密度（microlymphatic density,MLD）.结果 转染shRNA-VEGF-C后,Lovo细胞VEGF-C mRNA表达下调;体内实验结果显示,4周后shRNA-VEGF-C组移植瘤体积[（324.9±64.8）mm3]明显小于空质粒组[（553.5±90.1）mm3]和生理盐水对照组[（570.1±85.4）mm3]（P〈0.01）;shRNA-VEGF-C组瘤重[（3.01±0.55）g]也低于空质粒组[（4.65±0.65）g]和生理盐水对照组[（4.75±0.55）g]（P〈0.01）;shRNA-VEGF-C组微淋巴管密度LMVD（15.5±6.90）明显低于HK组（24.18±6.45）和生理盐水对照组（29.59±8.21）（P〈0.01）;shRNA-VEGF-C组局部淋巴结转移率（30.1%）明显低于空质粒组（50.2%）和生理盐水组（53.1%）.结论 shRNA-VEGF-C可影响VEGF-C诱导的淋巴管生成并抑制大肠癌淋巴结转移.
- 贺孝文刘霆陈道瑾
- 关键词：淋巴转移淋巴管生成
- 表达血管内皮生长因子-siRNA及双自杀基因yCDglyTK的联合基因载体构建及其应用研究被引量：2
- 2010年
- 构建了新型联合基因载体pcDNA3.1(-)VEGF-siRNA/yCDglyTK,研究其在人胃癌细胞系SGC7901细胞中的表达和杀伤作用.构建靶向血管内皮生长因子(VEGF)的干扰质粒pGenesil-VEGF-siRNA,采用PCR法从中扩增siRNA表达框(含U6启动子),亚克隆至双自杀基因载体pcDNA3.1(-)CV-yCDglyTK,构建联合基因质粒pcDNA3.1(-)VEGF-siRNA/yCDglyTK;通过酶切、测序等鉴定重组质粒;以磷酸钙纳米颗粒为载体,将干扰质粒、双自杀基因质粒及联合基因质粒转染SGC7901细胞,RT-PCR、Western-blot验证目的基因表达;MTT法检测转染细胞对5-氟胞嘧啶(5-FC)的敏感性.结果表明:酶切及测序证实联合基因载体pcDNA3.1(-)VEGF-siRNA/yCDglyTK构建成功;SGC7901细胞转染联合基因质粒后,RT-PCR、Western-blot证实融合自杀基因表达,而VEGF基因表达下调;在前体药物5-FC作用下,转染联合基因组细胞存活率最低,与其他组比较有统计学差异.成功构建联合基因载体pcDNA3.1(-)VEGF-siRNA/yCDglyTK,初步验证靶向VEGF的RNA干扰与双自杀基因系统具有协同效应.
- 叶玲张桂英刘霆陈选民易红肖志强冷爱民彭杰
- 关键词：RNA干扰自杀基因联合基因治疗
- 新型非病毒载体介导融合自杀基因靶向治疗胃癌的实验研究被引量：1
- 2010年
- 目的构建靶向性基因治疗载体pcDNA3.1(-)CVyCDglyTK,并以新型磷酸钙纳米为基因治疗载体,研究该基因治疗体系在胃癌细胞中体外与体内专一性表达和杀伤作用。方法采用PCR、RT-PCR、融合PCR、酶切及连接等技术构建由CEA启动子、CMV增强子驱动的融合自杀基因pcDNA3.1(-)CVyCDglyTK表达载体和融合自杀基因pcDNA3.1(-)CMVyCDglyTK表达载体。以磷酸钙纳米为载体分别转染CEA阳性的人胃癌细胞株SGC7901细胞和CEA阴性的Hela细胞.采用RT—PCR、免疫荧光法检测感染细胞中yCDglyTK基因的表达,并在体外观测其对胃癌细胞的作用。结果 SGC7901细胞在感染以上两种质粒表达载体后均有yCDglyTK mRNA表达,Hela细胞在转染纳米-pcDNA3.1(-)CMVyCDglyTK复合物后有yCDglyTK mRNA表达,对5-FC的敏感性增强,而在转染纳米-pcDNA3.1(-)CVyCDglyTK复合物后则没有yCDglyTK mRNA表达,5-FC对其亦无杀伤作用。在体外实验中,经纳米转染pcDNA3.1(-)CVyCDglyTK筛选的阳性克隆组细胞存活率为8.0%,纳米-pcDNA3.1(-)CVyCDglyTK转染组为25.4%,而对照组的细胞存活率为99.0%。结论本实验构建的由CEA启动子、CMV增强子驱动的融合自杀基因yCDglyTK靶向性基因治疗载体,能使融合自杀基因在CEA阳性的胃癌细胞中专一性表达,从而达到靶向治疗胃癌的目的 。
- 龚育凡刘霆陈选民张鸽文冷爱民彭杰张桂英
- 关键词：自杀基因胃癌
