国家自然科学基金(30070818)
- 作品数：15 被引量：81H指数：6
- 相关作者：杨连甲陈希哲杨维东董绍忠田卫东更多>>
- 相关机构：第四军医大学第四军医大学口腔医院四川大学华西口腔医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划北京市自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 可溶性肿瘤坏死因子受体对炎性牙周膜细胞的作用被引量：4
- 2006年
- 目的:分析可溶性肿瘤坏死因子受体及T淋巴细胞对炎性牙周膜细胞的作用。方法:实验于2005-03/09在解放军第四军医大学口腔医学院口内实验室完成。免疫磁珠分离CD3+T淋巴细胞于解放军第四军医大学唐都医院骨科实验室完成。CD3+T淋巴细胞取自正常人的外周血,牙周膜成纤维细胞和淋巴细胞培养液均购自美国Gbico公司,大肠杆菌内毒素购自Sigma公司,质粒引物合成及目的基因检测均于Takara公司完成。正常牙周膜成纤维细胞与CD3+T淋巴细胞共培养,加入大肠杆菌内毒素,实验组用PcDNA3.1(+)-可溶性肿瘤坏死因子受体转染细胞的培养液培养,对照组用转染空质粒的细胞培养液培养。空白组为正常牙周膜成纤维细胞加CD3+T淋巴细胞、正常牙周膜成纤维细胞加内毒素、正常牙周膜成纤维细胞。噻唑蓝法检测各组细胞24h和48h的活力变化;PcDNA3.1(+)-可溶性肿瘤坏死因子受体转染细胞后,免疫组化染色强阳性表达,转染培养液培养实验组细胞24h和48h后,噻唑蓝法检测实验组牙周膜细胞的活力变化。结果:①正常牙周膜成纤维细胞与CD3+T淋巴细胞共培养,内毒素刺激正常牙周膜成纤维细胞后,细胞活性降低;培养24h和48h后,噻唑蓝法检测各组的A值:正常牙周膜成纤维细胞和CD3+T淋巴细胞共培养组,加入内毒素刺激,24h为4.6±0.2,48h为3.7±0.1;用PcD-NA3.1(+)-可溶性肿瘤坏死因子受体转染细胞的培养液培养,24h为7.8±0.3,48h为6.9±0.5;正常牙周膜成纤维细胞用内毒素刺激,24h为9.0±0.4;48h为8.7±0.3;单纯正常牙周膜成纤维细胞与CD3+T细胞共培养,24h为10.1±0.2,48h为9.8±0.5;单纯培养牙周膜成纤维细胞,24h为10.0±0.5,48h为9.2±0.1。②转染空质粒PcDNA3.1(+)的牙周膜成纤维细胞其可溶性肿瘤坏死因子受体表达不明显,而转染质粒PcDNA3.1(+)-可溶性肿瘤坏死因子受体的牙周膜成纤维细胞其可溶性肿瘤坏死因子受体表达增强
- 刘艳丽杨连甲王秦芳董绍忠侯晋2
- 关键词：受体肿瘤坏死因子T淋巴细胞牙周膜内毒素类
- 组织工程颅骨缺损修复过程中超微结构观察被引量：3
- 2003年
- 目的 用组织工程骨修复 SD大鼠颅骨极量骨缺损 ,并在透射电镜下观察骨修复过程中成骨细胞、血管内皮细胞与陶瓷支架的关系。方法 14只雄性 SD大鼠 ,随机分成实验组和对照组 ,每组 7只。取左侧胫、股骨骨髓 ,体外诱导培养骨髓基质细胞。实验组将已分化的成骨细胞与含孔磷酸钙陶瓷复合用于修复大鼠自体颅骨极量骨缺损 ;对照组颅骨缺损处仅置入无细胞的陶瓷材料。分别于术后 4、8、12、16、2 0、2 4及 2 8周每组各处死 1只动物取材 ,制成脱钙超薄切片 ,透射电镜下观察成骨细胞、血管内皮细胞与陶瓷残余支架的关系。结果 实验组动物颅骨修复 12周前成骨细胞或成骨细胞样细胞毗邻新生小血管、血管内皮细胞存在 ,16周后成骨细胞转变为骨细胞 ,并围绕血管被包埋于骨基质及胶原纤维中 ;陶瓷残余与新生骨间有一条明显的钙化沉积带 ,大量胶原纤维已伸入到陶瓷支架的纳米级结构中。对照组陶瓷中央部位有大量小血管及血管内皮细胞增生 ,其周围多为幼稚成纤维细胞 ,无成骨细胞与血管内皮细胞的依附关系。结论 新型含孔磷酸钙陶瓷作为组织工程细胞支架 ,其间的纳米级结构有利于骨的再生和血管形成 ;未见来源于植骨床血管的内皮细胞衍变为成骨细胞。
- 陈希哲杨连甲田卫东李声伟
- 关键词：颅骨缺损超微结构血管内皮细胞陶瓷支架
- 重组人骨形成蛋白2基因转染大鼠自体骨髓基质细胞成骨能力研究被引量：2
- 2003年
- 目的 在构建的SD大鼠骨组织工程模型中 ,观察以含孔磷酸钙陶瓷为支架的基因转染自体骨髓基质细胞异位骨形成能力。方法 成年雄性SD大鼠 2 0只 ,全麻及无菌条件下取其左侧股骨及胫骨 ,将骨髓冲入75ml培养瓶中并在常规培养条件下进行体外扩增 ;5d后将部分骨髓基质细胞消化并通过LipofectAMINETM2 0 0 0介导进行重组人骨形成蛋白 (rhBMP2 )基因转染及G_4 18连续筛选 14d ;再将转染和未转染的自体细胞一同接种于经纤连蛋白表面修饰的含孔磷酸钙陶瓷上继续培养 10d,并将细胞陶瓷复合体对应地种植于大鼠背部皮下及肌肉内。分别于 2～ 2 0周处死动物 ,从形态学及组织学角度观察异位骨形成情况。结果 基因转染细胞陶瓷复合体无论种植于皮下或肌肉内均表现明显的异位骨形成能力 ;其同期骨形成与早期实验中的经诱导骨髓基质细胞陶瓷复合体异位骨形成相似。结论 应用以含孔磷酸钙陶瓷为支架的rhBMP2 基因转染自体骨髓基质细胞移植 ,可获得与诱导分化的自体骨髓基质细胞相同的成骨能力 ,说明基因转染自体骨髓基质细胞再次植入体内后 ,可相当于生物反应器 ,在增殖的同时促进干细胞的分化和成骨潜能。
- 陈希哲杨连甲田卫东杨维东
- 关键词：重组人骨形成蛋白2基因转染磷酸钙陶瓷
- 脲和二甲基亚砜对体外培养鼠成骨细胞活性和功能的影响被引量：6
- 2001年
- 目的探讨脲和二甲基亚砜（DMSO）对体外培养SD大鼠成骨细胞生物学特性的影响。方法分别以1％、2％、4％（V/V）浓度的脲或DMSO干预体外培养状态的SD大鼠成骨细胞3 d和6 d，进行形态学观察，检测细胞活力、细胞内蛋白总量（TP）及碱性磷酸酶（ALP）活性。结果经过脲或DMSO干预的成骨细胞，形态学上呈现营养不良样老化现象，细胞活力、TP和ALP光密度值均低于正常组。结论低浓度的脲或DMSO对成骨细胞的生物学性状影响较小，而较高浓度时可明显抑制细胞的正常活性，故不宜在细胞培养时用作非水容性物质的溶媒。
- 葛成杨连甲刘宝林
- 关键词：成骨细胞细胞培养
- 纤维连接蛋白对磷酸钙陶瓷表面修饰促进大鼠成骨细胞的贴附被引量：6
- 2001年
- 目的 :研究大鼠成骨细胞在经纤维连接蛋白表面修饰后的有孔磷酸钙陶瓷上的贴附及生长。方法 :4块立方形 (5mm× 5mm× 5mm)的有孔磷酸钙陶瓷 ,随机分成实验组和对照组。实验组陶瓷在负压条件下用重组人纤维连接蛋白 (10 0 μg/ml)浸渍过夜。再将两组陶瓷与大鼠成骨细胞共同培养 10d ,扫描电镜下观察比较实验组与对照组成骨细胞在陶瓷表面的贴附数量和形态。结果 :实验组成骨细胞的贴附数量显著高于对照组 (P <0 .0 1) ,并分泌大量胶原纤维和形成钙化结节。结论 :纤维连接蛋白对磷酸钙陶瓷的表面修饰能明显提高大鼠成骨细胞的贴附率 ,有利于成骨细胞的生长及成骨表型。
- 陈希哲杨连甲杨维东
- 关键词：磷酸钙陶瓷纤维连接蛋白表面修饰成骨细胞
- PcDNA3.1(+)-sTNFRⅠ真核表达载体在牙周膜细胞中的表达研究被引量：1
- 2006年
- 目的:构建真核表达质粒PcDNA3.1(+)-sTNFRⅠ,并转染人牙周膜细胞观察是否有目的产物的表达,研究其是否具有生物学活性,为进一步研究其在牙周治疗中的作用提供实验基础。方法:RT-PCR方法筛选目的基因,并构建质粒;ELISA方法检测牙周膜细胞转染PcDNA3.1(+)-sTNFRⅠ后培养上清中目的基因的表达;MTT检测目的产物是否在牙周膜细胞中有抑制TNF-α的作用。结果:成功重组构建了质粒PcDNA3.1(+)-sTN-FRⅠ,转染牙周膜细胞后,培养上清中目的产物sTNFRⅠ表达量实验组显著高于对照组,MTT检测表明表达产物具有生物学活性。结论:质粒PcDNA3.1(+)-sTNFRⅠ可以在牙周膜细胞中高效表达,并且可以抑制肿瘤坏死因子(TNF-α)的活性。为进一步研究TNFR在牙周病中的致病作用提供依据。
- 刘艳丽杨连甲董绍忠赵红萍
- 关键词：可溶性肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子牙周膜细胞转染
- 大鼠成骨细胞中蛋白激酶A的表达及信号作用被引量：2
- 2002年
- 目的 探讨蛋白激酶A(cAMP -dependentproteinkinase ,PKA)在大鼠成骨细胞中的表达情况。方法 纯化培养大鼠成骨细胞后 ,以cAMP、PKI、rhBMP -2分别刺激细胞 3 0min ,设空白对照 ,通过免疫细胞化学及图象分析方法 ,观察细胞内PKA的活化表达情况。结果 各实验组均可见PKAα的活化表达 ,但是空白对照组表达弱(p <0 .0 5 ) ,PKI组最弱 (p <0 .0 1) ,cAMP组表达最强 (p <0 .0 1)。结论 在大鼠成骨细胞中存在功能状态的PKAα ,而且 ,rhBMP -2能激活PKAα。rhBMP
- 葛成杨连甲刘宝林赵丽君
- 关键词：成骨细胞蛋白激酶A免疫细胞化学
- 人血管内皮生长因子165基因真核表达载体的构建及表达被引量：6
- 2003年
- 目的:构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)的真核表达载体,并在大鼠骨髓基质细胞中进行表达。方法:利用基因克隆技术,将原核克隆载体pSP73中的目的基因VEGF165用 BamH I和Xho I双酶切后,再克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,构建重组质粒pcDNA3.1-VEGF165。对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体介导,用重组质粒转染SD大鼠骨髓基质细胞,然后以G418筛选阳性克隆,用免疫细胞化学鉴定。结果:经酶切鉴定及基因测序证实,重组体中已插入目的基因片段VEGF165。免疫细胞化学证实,重组质粒转染的骨髓基质细胞中有VEGF165基因的表达。结论:成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165,并在骨髓基质细胞中得到表达,为将表达VEGF基因的骨髓基质细胞作为骨组织工程的种子细胞的可能性提供了实验依据。
- 高全文董绍忠陈希哲陈琰杨连甲
- 关键词：基因表达人血管内皮生长因子165基因真核表达载体
- 组织工程与基因工程联合应用于骨缺损修复的研究被引量：16
- 2001年
- 论证组织工程与基因工程联合应用于骨缺损修复的必要性及可行性。即利用基因操作将重组骨生长因子基因转入自体骨髓干细胞，再种植于生物材料上，用于骨缺损修复。
- 陈希哲杨连甲杨维东
- 关键词：基因工程骨缺损
- 含孔磷酸钙陶瓷复合自体成骨细胞骨组织工程大鼠模型的构建被引量：9
- 2002年
- 目的 构建封闭群动物SD大鼠骨组织工程模型 ,研究含孔磷酸钙陶瓷为支架复合自体成骨细胞的异位骨形成和极量骨缺损修复能力。方法 成年雄性SD大鼠 2 0只 ,全麻及无菌条件下取其左侧股骨及胫骨 ,将骨髓冲入 75ml培养瓶中并在诱导培养条件下进行体外扩增分化 ;培养 1 4d后将已具成骨细胞表型的细胞消化接种于经纤连蛋白表面修饰的含孔磷酸钙陶瓷上继续培养 1 5d ,再对应地将细胞 陶瓷复合体种植于大鼠皮下、肌肉内并用于颅骨极量缺损修复。分别于 2～ 2 0周处死动物 ,从形态学及组织学角度观察比较异位骨形成及骨缺损修复情况。结果 细胞 陶瓷复合体无论种植于皮下或肌肉内均表现明显的异位骨形成能力 ;颅骨极量缺损修复也优于同期仅植入经表面修饰但无细胞的陶瓷对照组。结论 应用封闭群动物SD大鼠构建的骨组织工程模型避免了采用免疫缺陷动物及同源近交系动物价格昂贵、近交衰退等缺点 ,其结果接近于临床 。
- 陈希哲杨连甲付崇建张庆诗
- 关键词：生物医学工程疾病模型磷酸钙类
