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一残毁性掌跖角化病家系GJB2基因突变研究被引量：2: 2012年; 目的对一个中国汉族残毁性掌跖角化病家系进行GJB2基因突变检测，以明确其致病基因。方法收集该家系5例患者、4例正常人和100例非该家系成员外周血和家系患者临床资料。提取基因组DNA，PCR扩增包括GJB2基因整个编码序列在内的1015bp，扩增产物纯化后应用ABI PRISM3730XL自动测序仪直接双向测序，Sequencher4．10．1Demo软件与基因组序列进行比对分析，查找有无突变基因。结果该家系所有患者GJB2基因均存在一个杂合错义突变196G→C，导致第一细胞外区域（E1）第66位天冬氨酸被组氨酸替代（即D66H），而家系中4例正常人和100例非家系成员正常人对照的DNA测序结果均未发现此突变。结论GJB2基因中D66H错义突变是中国汉族人群中残毁性掌跖角化伴耳聋的致病原因之一。; 王占想陈楠宋亚丽王震英郭小璇张莉; 关键词：皮肤角化病掌跖突变

iTRAQ技术筛选人黑素瘤A375细胞系let-7a靶标蛋白: 2016年; 目的同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术在人黑素瘤A375细胞系中筛选let-7a潜在的靶标蛋白，探讨let-7a的抑癌机制。方法100nmol／Llet-7a模拟物及其对照转染A375细胞，提取细胞总蛋白，运用同位素标记的iTRAQ技术分析和鉴定差异表达的蛋白质，运用生物信息学分析let-7a靶标蛋白及其功能，采用双荧光素酶报告系统验证靶标。结果let-7a模拟物组和对照组相比，质谱共分析鉴定到327个显著差异蛋白，其中表达量上调〉1．2倍的蛋白有151种，下调〈0．8倍的蛋白有176种。下调的176种蛋白中，软件预测到结合靶标有47个，双荧光素酶报告系统验证表明，let-7a模拟物组与对照组相比，HMGA2和THOC2野生型3’UTR比值分别降低64．3％和46．4％。结论iTRAQ技术和生物信息学方法在人黑素瘤A375细胞系中筛选出47个let-7a候选靶标蛋白，其中HMGA2和THOC2分别为let-7a的靶标。; 王焱张倩周晓伟王震英方方孙建方; 关键词：黑色素瘤细胞系微RNAS ITRAQ

miR-21、miR-494对黑素瘤A375细胞凋亡和细胞周期的影响被引量：4: 2013年; 目的探讨miR-21抑制物和miR-494模拟物转染A375细胞的最佳有效转染浓度及其对黑素瘤A375细胞增殖的影响。方法取6个浓度梯度的miR-21抑制物和miR-494模拟物转染A375细胞，实时荧光定量PCR法检测相应的miRNA。继而用Cy5标记的miRNA模拟物阴性对照转染A375细胞，荧光显微镜下观察转染效率。用流式细胞仪检测转染后细胞增殖的变化。结果从A375细胞中成功提出miRNA。定量PCR结果显示，当转染物miR-21抑制物浓度为120nmol／L时，转染细胞内有miR-21模拟物最大程度的下调表达，2^-△△Cr值为0．80（0．65～0．92），低于对照组；当miR-494模拟物浓度为250nmol／L时，转染细胞内有miR-494模拟物最大程度的上调，2^-△△Cr值为126．82（111．52～144．22），明显高于对照组；miR-21抑制物转染组与miR-494模拟物转染组G。期细胞比率分别为（61．61±3．25）％、（61．05±3．17）％，高于对照组（P〈0．05）；增殖指数分别为（38．39±3．25）％、（38．95±3．17）％，低于对照组（P〈0．05）；细胞凋亡率分别为（27．74±1．39）％、（34．30±2．35）％，高于对照组（P〈0．01），细胞转染效率达90％以上。结论miR-21抑制物和miR-494模拟物促使肿瘤细胞的G，期阻滞和促进凋亡作用，miR-21可增强A375细胞增殖，有原癌基因样功能；miR-494可抑制A375细胞增殖，有抑癌基因样作用。; 王焱王震英孙建方陈浩周武庆方方张国成; 关键词：黑色素瘤 MIRNA-21 转染细胞周期

人GJB6基因Tet—onHaCaT细胞稳定株的构建与鉴定: 2016年; 目的以Tet—on慢病毒为载体建立稳定表达GJB6基因及其突变体的HaCaT细胞株，为后续研究有汗性外胚层发育不良的发病机制奠定实验基础。方法利用PCR技术扩增人GJB6基因野生型与突变型（A88V）基因，重组Tet—Oil慢病毒质粒，经基因测序及酶切技术对其鉴定，再将重组慢病毒转染入HaCaT细胞，经嘌呤霉索筛选出稳定表达编码缝隙连接蛋白Cx30的GJB6基因的细胞株。细胞株加四环素诱导后，通过RT—PCR检测GJB6基因的mRNA表达量，同时通过Western印迹检测Cx30与FLAG标签肽的表达，从而对稳定表达GJB6基因的HaCaT细胞株进行鉴定。用CCK8法检测GJB6基因野生型与突变型经四环素诱导表达后对细胞增殖的影响。结果经酶切、测序鉴定，重组慢病毒质粒构建成功。RT—PCR检测到稳定转染的HaCaT细胞中GJB6基因mRNA表达量明显增加，感染野生型Tet—on慢病毒的HaCaT细胞组（wT组）加四环素GJB6基因表达丰度是wT组不加四环素的113．369倍（P〈0．05），感染突变型（A88V）Tet—on慢病毒的HacaT细胞组（MU组）加四环素GJB6基因表达丰度是MU组不加四环素的3．249倍（P〈0．05）；Western印迹可检测到经四环素处理的WT组和MU组稳定表达Cx30与FLAG，而未经四环素处理的细胞和感染阴性对照病毒的HaCaT细胞组（NC组）未检测到Cx30与FLAG目的条带。NC组加与不加入四环素在4、8、12、24、36、48h时的A值差异均无统计学意义（P〉0．05）；wT组加与不加入四环素在4、8、12、24、36h时的A值差异均有统计学意义（P〈0．05）；MU组加与不加入四环素在4、8、12、24、36、48h时的A值差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论成功构建出稳定表达GJB6基因野生型及其突变体A88V的HaCaT细胞株。; 路雨婷王震英宋亚丽姬灿灿张莉; 关键词：外胚层发育不良症连接蛋白类 HACAT细胞

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山东省科技发展计划项目(2011GSF11847)

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