辽宁省教育厅高等学校科学研究项目(2008T023)
- 作品数：8 被引量：42H指数：5
- 相关作者：柴晓杰薛飞张婷张晓琳余祝君更多>>
- 相关机构：大连海洋大学更多>>
- 发文基金：辽宁省教育厅高等学校科学研究项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 盐藻丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因DsSTPK的克隆、原核表达及纯化被引量：7
- 2014年
- 前期研究表明,盐藻丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶DsSTPK在转录水平上的表达受盐胁迫诱导。为了进一步研究该蛋白激酶的生理功能,通过RT-PCR扩增DsSTPK的开放阅读框,并将其克隆至pET32a(+)载体,得到重组表达载体pET32a(+)-DsSTPK。将重组表达载体转化E.coli.BL21(DE3),IPTG诱导表达,然后对融合蛋白进行表达形式分析,利用His60 Ni离子重力柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。本研究成功构建了重组表达载体pET32a(+)-DsSTPK,经IPTG诱导后表达出的融合蛋白的分子量与预期相符;表达形式分析显示该融合蛋白在上清和包涵体中均存在;将上清蛋白纯化后获得了纯度较高的融合蛋白;Western-blot检测显示该融合蛋白能被抗组氨酸抗体特异性识别,具有良好的免疫学活性。DsSTPK的成功表达、纯化,为下一步制备抗体,然后进一步在蛋白质水平上研究其在盐藻耐盐机制中的作用奠定了基础。
- 陶晓迎柴晓杰薛飞李秀娟丛玉婷
- 关键词：盐生杜氏藻原核表达纯化
- 盐藻小G蛋白基因(DsRab)的克隆及在高盐胁迫下的表达分析被引量：5
- 2013年
- 采用RT-PCR和RACE技术扩增了杜氏盐藻小G蛋白基因cDNA全长序列(GenBank Accession No.JN989548),命名为DsRab,对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR方法检测盐胁迫下该基因的表达情况。结果表明,DsRab基因的cDNA全长为1 299 bp,开放阅读框(ORF)为612 bp,编码203个氨基酸,5'非编码区78 bp,3'非编码区609 bp;保守性结构域分析可知编码的小G蛋白有4个GTP/GDP保守结构域,1个效应区、1个羧基端的半胱氨酸结构域和5个Rab亚家族共有的结构域;二级结构预测表明该蛋白有32.02%的α-螺旋,23.65%的伸展片段,44.33%的自由卷曲,三维建模成功;比对分析发现DsRab蛋白与多种生物的Ypt/Rab的氨基酸序列具有较高的同源性。荧光定量PCR结果表明,盐藻在高盐(3.0 mol/L)胁迫下,DsRab基因表达量显著上调,1 h后表达量达到最大值,为正常培养下对照组(0 h)的4.9倍,差异极显著(P<0.01)。
- 余祝君柴晓杰张晓琳张婷薛飞
- 关键词：杜氏盐藻RACE技术生物信息学荧光定量PCR
- 盐生杜氏藻MAPK基因的克隆及表达分析被引量：5
- 2013年
- 克隆盐藻MAPK基因(命名为DsMAPK),为研究盐藻耐盐分子机制奠定基础。采用RT-PCR和RACE技术克隆DsMAPKcDNA全长,对其进行生物信息学分析,并通过QRT-PCR方法检测盐胁迫下该基因的表达情况。DsMAPK的cDNA全长序列为1861bp(GenBank AccessionJQ782412),包含一个开放阅读框,长度为1407bp,编码468个氨基酸;DsMAPK蛋白为亲水性蛋白,α-螺旋和自由卷曲是其蛋白质二级结构的主要结构元件,伸展链散布其中。据氨基酸序列同源性分析表明,DsMAPK和衣藻、团藻的MAPK蛋白具有较近的亲缘关系。盐藻在高盐胁迫下,DsMAPK基因表达显著上调,1h后达到最大值,为正常对照组的5倍,差异极显著(P<0.01)。DsMAPK基因可能在盐藻对盐胁迫的反应中起重要作用,是一种参与盐藻耐盐反应的早期快速反应基因。
- 张婷柴晓杰王媛姜玉声丛玉婷
- 关键词：盐生杜氏藻CDNA生物信息学荧光定量PCR
- 盐藻DsMAPKKK基因的克隆与生物信息学分析被引量：1
- 2014年
- 为了阐明MAPKs级联反应在盐藻耐盐机制中发挥的作用,需要克隆MAPKs信号转导途径中的成员之一MAPKKK基因并研究其功能。采用RT-PCR与RACE技术从盐藻中首次克隆到一个盐藻MAPKK激酶基因,将其命名为DsMAPKKK(GenBank Accession No.KF366904)并进行了生物信息学分析。结果表明,DsMAPKKK基因的cDNA全长为1460 bp,开放阅读框为879 bp,编码292个氨基酸;该蛋白无信号肽,无跨膜域,是定位于细胞质基质的亲水性不稳定蛋白质;蛋白质序列中包含一个24—45位的蛋白激酶ATP结合区和一个137—149位的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性区;发现了多个潜在的磷酸化位点和一个重要的催化活性位点Asp141;蛋白质二级结构的主要组成元件为α-螺旋和自由卷曲;成功构建了蛋白质三级结构立体模型;系统进化分析表明该蛋白质与团藻、衣藻的相应蛋白进化关系最近。
- 王逸云柴晓杰韩冬梅刘世才郭卫华
- 关键词：盐藻全长CDNA生物信息学
- 盐藻CDPK基因的克隆与生物信息学分析被引量：16
- 2013年
- 为了研究CDPK基因的结构和功能,应用RT-PCR和RACE方法从盐藻Dunaliella salina中克隆得到CDPK基因(GenBank登录号为JQ964113),并对其进行生物信息学分析。结果表明:盐藻CDPK基因的cDNA全长3 052bp。5'-UTR长70bp;开放阅读框长1650bp,编码549个氨基酸;3'-UTR长1332bp。蛋白表现为弱酸性,且稳定、亲水,二级结构中以无规则卷曲和α-螺旋为主,三级结构同源建模成功。亚细胞定位于叶绿体和细胞核中,无跨膜结构域,无信号肽。蛋白序列中存在4个丝氨酸磷酸化位点、4个苏氨酸磷酸化位点和3个酪氨酸磷酸化位点,蛋白激酶结构域在53～331位氨基酸处,蛋白激酶ATP结合域在59～82位氨基酸处,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性域在173～185位氨基酸处,4个EF-hand钙结合域分别在357～385、393～421、429～457、465～493位氨基酸处。进化分析结果表明,克隆的CDPK基因与团藻、衣藻、盐藻Dunaliella tertiolecta的CDPK亲缘关系最近。为进一步研究CDPK基因的功能及探究盐藻耐盐机制的信号转导途径奠定了分子基础。
- 张晓琳柴晓杰张婷余祝君薛飞
- 关键词：盐藻CDNA全长生物信息学分析
- 盐藻新基因DsSTPK的克隆及生物信息学分析被引量：13
- 2012年
- 采用RT-PCR和RACE技术克隆了杜氏盐藻DsSTPK的1种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因(GenBank accession No.JN625213),命名为DsSTPK,并对其进行了生物信息学分析.结果表明,盐藻DsSTPK基因的cDNA全长为3 129 bp,可阅读框为2 184 bp,编码727个氨基酸.该蛋白为亲水性蛋白,无信号肽,无跨膜区域,为非跨膜蛋白,且定位于细胞质基质,二级结构的主要元件为无规卷曲和α螺旋,三维建模成功,在167～190位有1个蛋白激酶的ATP结合区、293～305位1个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性区,存在多个潜在的磷酸化位点.进一步的进化分析表明,其与衣藻、团藻亲缘关系最近.这些研究结果为进一步阐明DsSTPK的功能及作用机制奠定了基础.
- 薛飞柴晓杰余祝君张晓琳张婷
- 关键词：杜氏盐藻全长CDNA生物信息学分析
- 盐藻小G蛋白DsRab的原核表达及纯化被引量：1
- 2014年
- 前期对盐藻小G蛋白基因DsRab研究表明,在盐胁迫诱导下该基因转录水平明显提高。为进一步研究该蛋白在盐藻耐盐机制中的作用,PCR扩增DsRab的开放阅读框(ORF),并将其克隆至带有GST标签的原核表达载体pGS-21a,得到重组表达载体pGS-21a-DsRab。将重组表达载体转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并优化诱导表达条件,利用GST-SefinoseTM Kit进行纯化,用SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果表明,成功构建了重组表达载体pGS-21a-DsRab,SDS-PAGE结果显示得到的蛋白与预期分子量相符,并且纯度较高;Western blot检测结果初步证明该融合蛋白为GST-DsRab。
- 李秀娟柴晓杰陶晓迎赵欢丛玉婷
- 关键词：盐藻GST原核表达纯化
- 杜氏盐藻磷脂酶C基因DsPLC的克隆及盐胁迫下的表达分析被引量：6
- 2014年
- 为了研究磷脂酶C基因的结构与功能,采用RT-PCR和RACE技术从盐藻中克隆出了一种磷脂酶C基因(GenBank Accession No.KF573428),命名为DsPLC,并对其进行了生物信息学分析和盐胁迫条件下的表达分析。结果表明,DsPLC的cDNA全长2 628 bp,开放阅读框1 782 bp,编码593个氨基酸。该蛋白质为亲水性稳定蛋白,没有信号肽,也没有跨膜区域,是一种非跨膜蛋白,存在多个潜在的磷酸化位点,二级结构的主要元件为无规卷曲和α-螺旋。进一步的进化分析结果表明,盐藻与衣藻、团藻的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,正常情况下DsPLC的表达量很低,当受到高盐胁迫时表达量急剧升高,且在胁迫4 h时表达量达到最高,是对照组的10倍左右,差异极显著(P<0.01),表明DsPLC可能在盐藻抵御外界盐胁迫的过程中起重要作用。这些研究结果为进一步阐明DsPLC的功能及其作用机制奠定了分子基础。
- 韩冬梅柴晓杰王逸云刘世才岳文静
- 关键词：杜氏盐藻磷脂酶C全长CDNA生物信息学分析实时荧光定量PCR
