山东省自然科学基金(ZR2013HL066)
- 作品数：5 被引量：14H指数：1
- 相关作者：唐金宝杨洪鸣鞠辉军吕艳娜李志坚更多>>
- 相关机构：潍坊医学院潍坊护理职业学院更多>>
- 发文基金：山东省自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学文化科学医药卫生更多>>
- 生物技术制药课程教学改革的探索与实践被引量：11
- 2014年
- 笔者在生物技术制药课程教学中突破教材内容限制,重建课堂教学模块;注重文献阅读,引入"以文献为导向的自我学习"教学模式,加强学生科研思维训练;改进传统实验教学模式,设置生物技术制药综合性实验,强化实验技能、综合技能训练;实践证明我们进行的教学改革与探索对提高生物技术制药课程的教学质量及培养学生的科研技能等方面起到了积极的推动作用。
- 唐金宝鞠辉军许崇梅李志坚吕艳娜
- 关键词：生物技术制药教学改革教学探索教学实践
- 重组BirA酶的原核表达及其活性鉴定
- 2015年
- 构建含有r TEV酶切位点的原核表达载体p UC18-His-Bir A,利用E.coli DH5α表达重组Bir A酶,并通过酶切获得不含His标签肽的Bir A酶。PCR方式扩增Bir A基因片段重组至质粒p UC18,构建原核表达载体p UC18-His-Bir A并转化E.coli DH5α;采用冻融法释放菌体蛋白,SDS-PAGE分析目的蛋白的存在形式;冻融上清经金属离子亲和色谱纯化获得目的蛋白His-Bir A酶,利用r TEV酶切除His标签肽,并采用HABA方法进行Bir A酶活鉴定分析。经双酶切验证、基因测序结果表明重组载体构建正确,SDS-PAGE结果显示表达产物可溶部分比例约占50%;利用r TEV酶将标签切除,经HABA测定该酶相对酶活性可达4 365 U/μg。该研究通过构建p UC18-His-Bir A质粒表达载体,实现了重组Bir A酶较高比例的可溶性表达。表达产物经r TEV酶酶切后具有较高的酶活性,为实现Bir A酶的经济、高效制备奠定了一定的实验基础。
- 赵爽佳鲍如梦唐海科杨洪鸣唐金宝
- 关键词：酶活性
- 大肠杆菌碱性磷酸酶在E.coli BL21(DE3)中的胞内可溶性表达被引量：1
- 2014年
- 目的构建原核表达载体pEAP,在E.coil BL21(DE3)中实现大肠杆菌碱性磷酸酶(Escherichia coli alkaline phosphatase,EAP)的胞内可溶性表达,为进一步研究工程菌的大体积培养条件、提高其表达量提供理论基础。方法以质粒pDAP2为模板扩增不含信号肽的EAP基因,克隆至pGreen-S质粒构建表达载体pEAP,以E.coli BL21(ED3)菌株表达EAP,采用SDS-PAGE及EAP酶活性测定对表达产物的可溶性及胞内定位进行分析;Ni2+亲和层析方式纯化目的蛋白并测定其比活力。结果经PCR、双酶切及测序分析证实载体构建正确,所表达目的蛋白主要以可溶性形式存在于BL21(ED3)菌体细胞质,其相对分子量与理论值相符(47kD)且具有EAP催化活性;目的蛋白经His Trap亲和层析纯化后,其电泳纯度在90%以上,酶比活力可达358.6 U/mg。结论成功构建pEAP质粒表达载体,目的蛋白在BL21(ED3)菌株胞内主要以可溶性形式表达,为进一步更经济、高效制备EAP奠定了一定的实验基础。
- 包剑铭郭小帆赵雪飞李雨丽梁艺旋唐金宝
- 关键词：大肠杆菌碱性磷酸酶细胞质可溶性表达
- ZZ亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白的制备与初步应用被引量：1
- 2015年
- 目的:构建、表达ZZ亲和肽与碱性磷酸酶(AP)融合蛋白,并研究其生物学活性。方法:将ZZ亲和肽基因与AP基因重组,构建原核表达载体p EZZ-AP并利用大肠杆菌表达,金属离子亲和层析纯化目的蛋白,Western blot鉴定ZZ-AP生物学活性并初步应用于免疫细胞化学。结果:所构建重组质粒p EZZ-AP经E.coli DH5α表达,SDS-PAGE结果显示目的蛋白相对分子量为62 k D,与理论值相近。Western blot结果表明ZZ-AP融合蛋白既具有兔Ig G抗体结合活性,又具有碱性磷酸酶活性,在细胞免疫组化应用中与AP标记的羊抗兔二抗显色模式与效果相似。结论:ZZ-AP融合蛋白构建成功,该融合蛋白具有兔Ig G抗体结合活性和碱性磷酸酶活性,细胞免疫组化应用结果表明该融合蛋白在免疫分析中具有潜在的应用价值。
- 鲍如梦赵爽佳薛敏杨洪鸣唐金宝
- 关键词：碱性磷酸酶融合蛋白
- 基于Avi-tag技术的双生物素分子位点专一性标记的增强型绿色荧光蛋白被引量：1
- 2015年
- 目的:利用Avi-tag技术制备双生物素分子位点专一性标记的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。方法:PCR方式扩增EGFP基因片段,重组至带有双Avi-tag标签的中间质粒载体pdi-Avitag,构建原核表达载体p EGFP-(Avitag)2并转化E-.coli DH5α;表达菌株菌体冻融上清经金属离子亲和色谱纯化目的蛋白EGFP-(Avitag)2,以Bir A酶体外催化生物素分子与目的蛋白在Avi-tag位点的生物连接,并以Western blot和竞争ELISA鉴定生物素化产物EGFP-B2的生物素化效果。结果:成功构建p EGFP-(Avitag)2载体,并在E.coli DH5α中可溶性表达EGFP-(Avitag)2,经Western blot和竞争ELISA鉴定,EGFP-(Avitag)2分子经Bir A酶体外催化可连接两个生物素分子。结论:成功获得双生物素分子位点专一性标记的增强型绿色荧光蛋白,为其在BAS体系中的应用奠定了研究基础。
- 赵爽佳鲍如梦唐海科包雪翠杨洪鸣唐金宝
- 关键词：增强型绿色荧光蛋白生物素化
