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德式乳杆菌保加利亚亚种thyA基因缺陷型菌株的构建被引量：4: 2015年; 目的:获得由插入序列ISS1构建的德式乳杆菌保加利亚亚种胸腺嘧啶合成酶thy A基因缺陷型菌株。方法:利用两端带有ISS1的载体p Ghost9:ISS1,经复制型转座构建突变体,以50μg/m L脱氧胸苷、梯度浓度三甲氧苄胺嘧啶(TMP)连续富集传代培养,以添加终质量浓度50μg/m L脱氧胸苷的SA平板以及未添加脱氧胸苷的SA平板筛选thy A基因缺陷型菌株。结果:获得生物学性状稳定,回复突变率低的thy A基因插入突变株。; 李晨郭鑫卢海强田晶晶谷新晰田洪涛罗云波; 关键词：P THY A基因插入突变

酸奶中保加利亚乳杆菌后酸化的评价被引量：1: 2013年; 为了解酸奶发酵菌株的后酸化程度,本研究以引起酸奶后酸化的主要菌株保加利亚乳杆菌为研究对象,利用来自不同乳制品或常用浓缩型发酵剂中的6株保加利亚乳杆菌发酵酸奶,分析了不同菌株的发酵性能,酸奶在低温贮存过程中pH值、滴定酸度及活菌数的变化。在供试的菌株中,L.b-TX、L.b-MH凝乳时间较长,后酸化程度高,因此发酵酸奶质量不稳定,不是优质发酵剂菌株。其他菌株发酵性能和后酸化程度较好。评价酸奶发酵菌株的后酸化程度,是选育优质保加利亚乳杆菌的基础,这将推动自主知识产权的酸奶发酵剂的研发。; 李晨李程谷新晰田洪涛; 关键词：保加利亚乳杆菌酸奶后酸化发酵剂

利用pGhost系统筛选抗后酸化保加利亚乳杆菌被引量：5: 2015年; 目的:利用p Ghost系统构建抗后酸化保加利亚乳杆菌。方法:利用载体p Ghost9:ISS1经复制型转座构建突变体,之后在p H 4.3条件下,突变细胞用含终质量浓度2 000μg/m L青霉素处理5 h。将处理后的菌液涂布在含终质量浓度2μg/m L红霉素的MRS平板上,长出的菌落分别点种p H 4.3和p H 6.5的MRS平板进行筛选,在低p H值条件下生长不良或不生长的菌株即目的菌株。经进一步检验,筛选发酵性能与出发菌株相当,而贮藏期后酸化能力大为减弱的菌株。将筛选出的抗后酸化菌株通过低温刺激,使转座后的载体重组,载体部分从染色体上切除,并经高温培养后丢失。剔除载体后的突变型菌落是食品级突变体,为红霉素敏感型。结果:获得3株抗后酸化保加利亚乳杆菌菌株,其生物学性状稳定,回复突变率低。; 李晨赵云郭鑫卢海强田洪涛郭兴华罗云波; 关键词：保加利亚乳杆菌

保加利亚乳杆菌不同环境胁迫的交互保护作用及其基因表达分析: 2022年; 保加利亚乳杆菌是发酵乳制品常用主要菌种,经常受到多种环境胁迫。为了深入揭示其抗逆保护机制,在确定保加利亚乳杆菌模式菌株ATCC 11842不同环境胁迫(酸、盐、胆盐、氧、冷)下的亚致死与最低致死条件的基础上,通过比较不同环境胁迫亚致死条件处理后的菌体细胞的存活率变化,研究菌体细胞在多重胁迫环境下的交互保护作用。根据前期ATCC 11842菌株在酸胁迫和酸冷胁迫条件下转录组学测序结果,从响应酸胁迫的基因中选取与糖代谢、氨基酸代谢、转运系统、分子伴侣、应激等相关11个基因,利用RT-qPCR技术分析11个基因在不同环境胁迫下转录水平的表达量变化。结果表明:ATCC 11842菌株经酸胁迫和氧胁迫亚致死条件(pH 4.8,40 min;15 mmol/L H_(2)O_(2),1 h)预处理后,均可显著提高最低致死条件下的存活率,在ATCC 11842菌株体内响应酸胁迫的11个基因中,有10个基因也响应其它不同环境胁迫,并探明这10个响应酸胁迫的基因(LDB_RS02110、LDB-RS00810、LDB_RS04920、LDB_RS05285、LDB_RS00230、LDB_RS06340、LDB_RS05615、LDB-RS01180、LDB_RS06995、LDB_RS03130)在不同环境胁迫下的表达变化。; 张鑫李晨张帅张帅王羽田洪涛; 关键词：保加利亚乳杆菌交互保护作用转录水平基因表达分析

酸冷胁迫下保加利亚乳杆菌定量PCR内参基因的筛选被引量：2: 2021年; 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确等优点,被广泛应用于目的基因表达的定量分析,而筛选表达水平稳定的内参基因是提高qRT-PCR结果准确性的重要前提。保加利亚乳杆菌既是酸奶发酵剂的常用菌种,又是引起酸奶后酸化的主要菌种。为了筛选保加利亚乳杆菌后酸化相关功能基因表达分析的qRT-PCR内参基因,以保加利亚乳杆菌的模式菌株ATCC 11842为试验菌株,根据前期ATCC11842菌株在后酸化不同条件下转录组学测序结果,选择5个候选内参基因(16SrRNA、rpoB、ldh、rodA、recA),通过qRT-PCR技术研究候选内参基因在酸胁迫和酸冷胁迫下的表达量水平,即Ct值变化。采用3款软件geNorm、NormFinder和Bestkeeper分析比较候选内参基因在酸胁迫和酸冷胁迫下qRT-PCR的表达稳定性,并筛选获得qRT-PCR的最适内参基因。运用筛选到的最适内参基因,分析ATCC 11842菌株的3个目的基因(poxI、Ldb1301、dnaJ)在酸胁迫和酸冷胁迫下qRT-PCR的相对表达量,验证筛选的内参基因的可靠性。结果表明:同一候选内参基因Ct值在酸胁迫和酸冷胁迫下,rpoB和recA表达量变化最小。比较3个软件分析结果,一致得出:rpoB和recA是在酸胁迫和酸冷胁迫下表达最稳定的2个基因,即筛选出的qRT-PCR最适内参基因为rpoB和recA;3个目的基因(poxI、Ldb1301、dnaJ)在酸胁迫和酸冷胁迫下qRT-PCR的相对表达量的分析结果与前期转录组学测序结果一致,进一步证实本研究筛选的2个内参基因rpoB和recA的可靠性。本文为利用qRT-PCR技术研究保加利亚乳杆菌后酸化功能基因表达以及揭示后酸化机制及定向选育弱后酸化菌株提供了依据;也为采用qRT-PCR技术研究其它益生乳酸菌引起酸奶后酸化或不同条件下功能基因表达提供借鉴。; 孙永胜许沙王宇航魏新燕李晨康红彦田洪涛; 关键词：保加利亚乳杆菌后酸化内参基因

乳酸菌红色荧光蛋白融合表达系统的构建被引量：1: 2017年; 目的:构建以红色荧光蛋白基因(dsred2)为标记的乳酸菌融合表达系统p MG36e-dsred2,并以α-淀粉酶(amy)为报告基因实现融合基因dsred2-amy在乳酸菌内的融合表达。方法 :通过PCR的方法以质粒p PIC9kdsred2为模板扩增得到dsred2基因的全部编码区序列,并将其连接到克隆型载体p MG36e上,得到重组载体p MG36e-dsred2。以地衣芽孢杆菌基因组为模板,扩增只带有起始密码子而不带有终止密码子的α-淀粉酶基因(amy),将其连接到克隆型载体p MG36e-dsred2上,获得融合表达载体p MG36e-dsred2-amy。最后将该载体电转化干酪乳杆菌,利用荧光显微镜观察红色荧光基因表达情况,用淀粉平板检测淀粉酶活性。结果:通过PCR的方法分别扩增到大小为694bp的红色荧光蛋白基因(dsred2)和大小为1 554 bp的淀粉酶基因(amy)。将获得的两个基因片段进行测序,结果与NCBI数据库进行对比,dsred2基因的匹配率为100%,amy基因同源性为99.54%。成功构建了乳酸菌表达系统p MG36e-dsred2及融合表达载体p MG36e-dsred2-amy。在荧光显微镜下观察菌体有荧光且淀粉平板上有明显的透明圈。结论:融合表达载体的构建成功为乳酸菌在生物体内的定植、分布、存活等研究提供了方法,也为研究外源蛋白在乳酸菌内的表达的分泌(细胞内、细胞壁、细胞外表达)、活性检测等奠定了基础。; 寇田田北婷婷李晨许沙田洪涛罗云波; 关键词：乳酸菌融合表达载体红色荧光蛋白淀粉酶

酸奶后酸化中保加利亚乳杆菌关键基因表达分析被引量：9: 2018年; 酸奶中的乳酸菌能将大分子蛋白质分解成人体易吸收的小分子营养物质,这对人体具有很重要的保健功能,然而酸奶的后酸化问题不仅严重影响风味,还大大缩短了酸奶的货架期,阻碍了我国酸奶行业的发展。研究证明,控制保加利亚乳杆菌在酸奶发酵后期的生长代谢,是解决酸奶后酸化的关键。本文在研究模式菌株保加利亚乳杆菌ATCC 11842在复原脱脂乳培养基中生长和产酸特性的基础上,利用半定量RT-PCR技术,分析酸奶后酸化中保加利亚乳杆菌不同时期关键基因表达的差异,选取后酸化过程中表达变化明显的丙糖异构酶基因,通过对该基因的过量表达,探究该基因在酸奶后酸化过程中的功能。结果表明,大多数关键基因受到后酸化的影响而上调或下调,其中丙糖异构酶基因过量表达后影响菌株产酸和生长。; 李晨张国文赵云卢海强田洪涛罗云波; 关键词：保加利亚乳杆菌后酸化半定量RT-PCR

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国家自然科学基金(31301520)

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