天津市自然科学基金(043608411)
- 作品数：8 被引量：12H指数：3
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- 相关机构：天津医科大学华北煤炭医学院天津市泌尿外科研究所更多>>
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- 人天然噬菌体抗体库的构建及抗gp96抗体的初步筛选
- 2009年
- 目的构建人天然Fab段抗体库，并用从膀胱尿路上皮癌组织中提取纯化的gp96筛选抗gp96特异性抗体，为恶性肿瘤的免疫治疗提供新方法。方法取4个健康献血员新鲜血液各200ml，分离淋巴细胞，提取总RNA，经逆转录合成cDNA，设计多对引物，以PCR扩增抗体轻链和重链Fd段cDNA。轻链PCR产物和噬粒载体pComb3经Sac Ⅰ和Xba Ⅰ酶切，由T4 DNA连接酶连接，电穿孔转化感受态大肠杆菌XL1-Blue，扩增后提取噬粒，构建轻链库。轻链库和重链Fd段PCR产物经Xho Ⅰ和Spe Ⅰ酶切，以同样方法连接后转化XL1-Blue，加入辅助噬菌体VCSM13，产生噬菌体抗体全库。提取噬粒酶切鉴定轻链库和全库有无插入片段。分别以噬菌体全库和提取的噬粒为模板，以轻、重链不同引物组合进行PCR扩增。应用亲和层析和离子交换层析从膀胱癌组织中提取纯化gp96，并以此为抗原对构建的抗体库进行3轮筛选。结果提取的淋巴细胞总RNA及逆转录合成的cDNA质量好，部分重链Fd片段、部分κ轻链和λ轻链cDNA得到扩增。Fab全库库容达6．6×10^6，酶切和PCR显示有插入片段。用从膀胱尿路上皮癌组织中提取出的gp96进行3轮筛选，抗体库得到68倍的富集。结论本研究构建的人天然Fab段噬菌体抗体库可为进一步筛选特异性抗体、肿瘤免疫治疗打下基础。
- 马小兵畅继武李成文李慧忠王馨
- 关键词：噬菌体抗体库抗体FAB段GP96膀胱尿路上皮癌
- 人天然Fab段噬菌体抗体库的构建被引量：2
- 2005年
- 目的通过构建人天然F ab段噬菌体抗体库为恶性肿瘤的免疫治疗提供新方法。方法取4个健康献血员新鲜血液各200m l,分离淋巴细胞,提取总RNA,经逆转录合成cDNA,设计多对引物,以PCR扩增抗体轻链和重链Fd段cDNA。轻链PCR产物和质粒载体pCom b3经SacⅠ和X baⅠ酶切,由T 4 DNA连接酶连接,电穿孔转化感受态大肠杆菌XL 1-B lue,扩增后提取质粒,构建轻链库。轻链库和重链Fd段PCR产物经X hoⅠ和SpeⅠ酶切,同样方法连接转化XL 1-B lue,加入辅助噬菌体VCSM 13产生噬菌体抗体全库。酶切鉴定轻链库和全库有无插入片段。结果提取的淋巴细胞总RNA质量好,部分重链Fd片段、部分κ轻链和λ轻链cDNA得到扩增。F ab全库库容达5.4×106,酶切证实有插入片段。结论本研究构建的人天然F ab段噬菌体抗体库可为进一步筛选特异性抗体及从肿瘤组织中提取肿瘤抗原用于免疫治疗奠定基础。
- 马小兵畅继武王海涛王馨马腾骧
- 关键词：噬菌体抗体库抗体FAB段抗体工程
- 抗TNF-α蛋白Fab抗体的制备和鉴定
- 2008年
- 目的制备人源性抗肿瘤坏死因子(TNF)-α蛋白的可溶性Fab抗体。方法用固相化的TNF-α蛋白从人天然Fab噬菌体抗体库中筛选出表达抗TNF-α蛋白Fab抗体的阳性克隆,经酶切及连接反应构建可溶性表达噬菌粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG高效可溶性表达,SDS-PAGE及Western blot分析鉴定抗体表达情况,ELISA鉴定其抗原结合活性和特异性。结果筛选并表达了人源性抗TNF-α蛋白的Fab抗体,在非还原SDS-PAGE中形成相对分子质量47 kD的条带;Western blot分析证实表达的蛋白即Fab抗体;ELISA筛选出的2株抗体(TA-04、TA-13)具有良好的抗原特异性和抗原结合活性,与小牛血清白蛋白无交叉反应。结论成功制备并鉴定了人源性抗TNF-α蛋白的可溶性Fab抗体。
- 李常颖李宏杰张婷畅继武
- 关键词：噬菌体抗体库肿瘤坏死因子-Α
- 热休克蛋白gp96与肿瘤免疫研究进展被引量：3
- 2005年
- 热休克蛋白gp96作为分子伴侣参与了肿瘤抗原向MHC-I类分子途径的递呈过程,并与抗原肽形成gp96-肽复合物激活CD8+T淋巴细胞,产生抗肿瘤的特异性免疫反应。此外,还能不依赖于抗原肽通过激活NF-κB信号转导,产生细胞因子和趋化因子,诱导树突状细胞成熟等多种作用而调节非特异性免疫反应。gp96-肽复合物疫苗为肿瘤的免疫治疗提供了新的思路。
- 马小兵畅继武
- 关键词：GP96肿瘤免疫抗原递呈
- 基因工程技术制备抗IL-2蛋白抗体Fab片段及其鉴定方法的建立
- 2008年
- 目的利用基因工程技术制备人源性抗IL-2蛋白的可溶性Fab抗体片段,并鉴定其抗原结合活性及特异性。方法用固相化的IL-2蛋白从人天然噬菌体抗体库中筛选出表达抗IL-2蛋白Fab抗体片段的阳性克隆,酶切及连接反应构建可溶性表达噬菌粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定其抗原结合活性和特异性。结果成功筛选并表达了抗IL-2蛋白的Fab段抗体,在SDS-PAGE中形成47kD的条带,Western blot证明为抗人Fab段抗体;ELISA证实该抗体片段具有良好的抗原特异性和抗原结合活性,与牛血清白蛋白、IL-4无交叉反应。结论成功表达并鉴定了人源性抗IL-2蛋白的可溶性Fab片段,构建了一种制备基因工程抗体的有效途径,为基因工程抗体在肿瘤免疫治疗方面的临床应用研究奠定了基础。
- 李常颖李宏杰畅继武
- 关键词：噬菌体抗体库白细胞介素2
- 噬菌体抗体库技术被引量：3
- 2005年
- 噬菌体抗体库技术是指从人外周血、脾或骨髓淋巴细胞提取总RNA,利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法扩增抗体的全套可变区基因,通过噬菌体表面展示技术,把抗体Fab段或单链抗体表达在噬菌体表面,构建人源抗体库。噬菌体抗体将基因型(genotype)和表型(phenotype)统一于一体,将选择能力和扩增能力偶联起来,具有强大的筛选能力,能够在体外模拟体内的抗体生成过程,使抗体工程技术进入了一个新的时代。
- 马小兵畅继武
- 关键词：噬菌体抗体噬菌体抗体库技术多聚酶链反应可变区基因人外周血总RNAFAB段
- 人天然Fab段噬菌体抗体库的构建及初步鉴定被引量：5
- 2006年
- 目的构建人天然Fab段噬菌体抗体库,建立人源抗体制备技术平台,为恶性肿瘤的免疫治疗提供新方法。方法从一个健康献血员取200ml新鲜血液,分离淋巴细胞,提取总RNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增抗体轻链和重链Fd段cDNA,依次将PCR产物插入载体pComb3相应位点,电穿孔转化感受态大肠杆菌XL1-Blue,加入辅助噬菌体VCSM13产生噬菌体抗体库,酶切和PCR鉴定有无插入片段,用白蛋白和IL-2作为抗原进行筛选富集。结果部分重链Fd片段、部分κ轻链和λ轻链cDNA得到扩增。Fab表达库容达约1·2×106,酶切和PCR显示有插入片段。用不同蛋白进行几轮筛选,抗体库得到了不同程度的富集。结论本研究构建的人天然Fab段噬菌体抗体库可为进一步筛选特异性抗体,用于免疫治疗打下基础。
- 马小兵畅继武王海涛王馨马腾骧
- 关键词：噬菌体抗体库抗体FAB段抗体工程
