国家自然科学基金(30800654)
- 作品数：9 被引量：19H指数：3
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- “自组装”工程化软骨在裸鼠体内的生物学改建
- 2011年
- 目的应用“自组装”培养技术联合生长分化因子5（GDF-5）体外构建工程化软骨，比较裸鼠体内植入前后软骨相关生物学特性的差异。方法密度梯度离心法分离培养成人骨髓间充质干细胞（hMSCs）。将第3代hMSCs用含GDF-5的软骨诱导液定向诱导培养，诱导3周后重悬细胞，以5×10^6个／ml的细胞终质量浓度接种于2％琼脂糖包被的24孔板，行自组装培养，体外培养6周后部分标本植入裸鼠皮下，再经体内6周后取材。通过大体观察、组织学、免疫组织化学、逆转录．聚合酶链反应（RT-PCR）、生物化学和生物力学检测等方法对体内植入前后标本的软骨相关生物学特性进行比较。结果体外培养6周时预分化的hMSCs“自组装”形成了软骨样组织，但质地较软，弹性较差。体内植入6周后，“自组装”工程化软骨能维持良好的软骨外观。体外标本的糖胺聚糖（GAG）含量为（6．32±0．47）ug/mg，弹性模量为（5．40±0．64）MPa，分别仅是体内标本的69．8％和26．1％。组织学染色显示体内标本的异染基质及Ⅱ型胶原显色程度均明显强于体外标本，RT-PCR结果也反映出这一变化。结论应用“自组装”技术联合GDF-5构建的工程化软骨在裸鼠体内皮下环境中能维持良好的软骨特性，并且体内环境能促进其生物学改建及进一步发育成熟。
- 孙志博杨述华张宇坤张波许伟华叶树楠
- 关键词：骨髓间充质干细胞自组装生长分化因子5
- 自组装培养形成软骨组织的研究被引量：4
- 2010年
- 目的 探讨通过＂自组装＂（Self-Assembly）培养技术,以生长分化因子-5（GDF-5）诱导人骨髓间充质干细胞（hMSCs）,分化形成软骨组织的可能性及效果.方法 将第3代hMSCs用含GDF-5的软骨诱导液定向诱导培养.3周后重悬细胞,自组装培养.对自组装组织团块经行大体观察、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫组织化学、软骨相关染色检测.结果 自组装组织团块有类似于软骨的外观,Ⅱ型胶原mRNA表达明显,组织学显示Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达阳性.GDF-5诱导组Ⅱ型胶原免疫组织化学平均吸光度为（0.1678±0.0222）,对照组平均吸光度为（0.0908±0.0145）,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 自组装法培养hMSCs能形成具有软骨分子生物学、组织学和生物力学特性的组织团块,而GDF-5能够增强此过程中细胞的软骨表达.
- 夏天杨述华张宇坤张波杜靖远李进
- 关键词：生长分化因子5骨髓间充质干细胞
- 不同细胞接种密度体外构建“自组装”工程化软骨的实验研究被引量：1
- 2012年
- [目的]探究以人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hMSCs)为种子细胞体外构建"自组装"工程化软骨对应的合理细胞接种密度。[方法]体外分离与培养hMSCs。用含100 ng/ml生长分化因子5(growth differentiation factor 5,GDF-5)的软骨诱导液(chondrogenic medium,CM)定向诱导培养第3代hM-SCs,诱导3周后重悬细胞,分别以A组2.5×106/ml,B组5×106/ml,C组1×107/ml,D组2×107/ml四种细胞密度接种于2%琼脂糖包被的24孔板,每组设5个复孔。自组装培养3周后,对标本进行大体观察、组织学及免疫组化检测并进行生化分析,比较不同组标本的软骨生物学特性的差异。[结果]"自组装"培养3周后,各组都形成了软骨样组织团块,团块直径与湿重随细胞接种密度而增加。Bern评分结果显示C、D两组明显高于A、B两组(P<0.05),且C组与D组间差异无统计学意义,Ⅱ型胶原免疫组化染色检测到C组与D组细胞外基质内有较强的阳性信号弥漫分布,蛋白多糖(GAG)含量C、D两组亦明显高于A、B两组(P<0.05),且C组与D组间差异无统计学意义。[结论]在一定细胞接种密度范围内,"自组装"工程化软骨的生物学特性呈密度依赖性增加。以1×107/ml接种时,可以获得具有良好生物学特性的"自组装"工程化软骨。
- 贾杰杨述华张宇坤孙志博
- 关键词：成人骨髓间充质干细胞生长分化因子5软骨分化
- 生长分化因子5诱导人骨髓间充质干细胞微团成软骨分化的研究被引量：3
- 2011年
- [目的]探讨应用生长分化因子5(growth differentiation factor 5,GDF-5)诱导人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hMSCs)微团成软骨分化的可行性及效果。[方法]体外分离培养hMSCs,取第3代细胞实验。将hMSCs分别用无血清H-DMEM和含10、20、50、100 ng/ml GDF-5的软骨诱导液(chondrogenic medium,CM)诱导,显微镜下观察细胞形态变化,MTT法检测各组细胞的增殖情况。诱导2周后重悬细胞,以5×106/ml的细胞密度离心构建微团,继续诱导2周。RT-PCR检测两组细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达。免疫组化、甲苯胺蓝染色检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达。[结果]hMSCs呈梭形、漩涡状生长。100 ng/ml GDF-5诱导的hMSCs呈圆形或多角形。五组微团分别由无血清H-DMEM、含10,20,50,100 ng/ml GDF-5的软骨诱导液诱导2周后,除H-DMEM组无Ⅱ型胶原mRNA、Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖的表达外,其他各组Ⅱ型胶原mRNA、Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖的表达呈浓度依赖性增加,各组差异均有统计学意义(P<0.05)。[结论]经一定浓度GDF-5诱导的hMSCs微团,Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达呈浓度依赖性增加,具有软骨的部分生物学功能。
- 孙志博杨述华张宇坤张波夏天王永清
- 关键词：成人骨髓间充质干细胞生长分化因子5微团培养软骨分化
- 低氧环境和生长分化因子-5联合诱导促进人骨髓基质干细胞分化成软骨细胞的研究被引量：1
- 2011年
- 目的探讨低氧环境下生长分化因子-5（GDF-5）诱导人骨髓基质干细胞（hBMSCs）“自组装”形成工程化软骨的可行性和有效性。方法分离培养hBMSCs，流式细胞学方法鉴定。将hBMSCs用含100ng／mLGDF-5软骨诱导液（cM）分别在低氧（A组）和正常氧（B组）环境下诱导培养3周，RT-PCR检测Ⅱ型胶原和Aggrecan表达情况。将A、B两组hBMSCs消化后，按一定密度接种于2％琼脂糖包被的24孔板，在不同氧浓度下CM继续诱导3周，免疫组化法检测组织I、Ⅱ型胶原表达，甲苯胺蓝染色检测葡萄糖胺聚糖（GAG）表达。结果hBMSCs呈梭形漩涡状生长，高表达CD44、CD29，不表达CD45分子。诱导5d后A组细胞较B组明显增殖，诱导10dA组细胞体积较B组小。含GDF-5的CM诱导hBMSCs3周后，Ⅱ型胶原和AggrecanmRNA表达阳性，A组Ⅱ型胶原和Aggrecan表达量较B组均明显增加，差异有统计学意义（P〈0．05）。GDF-5诱导hBMSCs可“自组装”形成一定形状大小类软骨样组织，A组Ⅱ型胶原表达较B组增加，A组I型胶原表达量下降，B组表达阳性；A组甲苯胺蓝染色异染加深。结论低氧促进GDF-5诱导hBMSCs向软骨分化，低氧环境下GDF-5诱导软骨分化的hBMSCs“自组装”形成的工程化软骨更具有软骨表型。
- 张波杨述华张宇坤孙志博夏天许伟华叶树楠
- 关键词：软骨细胞骨髓细胞
- 生长分化因子5真核表达质粒转染小鼠骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化被引量：1
- 2009年
- 背景:生长分化因子5是软骨与骨组织形成、发育的重要调解因子,在诱导软骨形成,促进骨、软骨、肌健韧带损伤修复方面发挥重要作用。目的:小鼠骨髓基质干细胞体外转染真核表达质粒pcDNA3.1(+)/生长分化因子5,检测与软骨形成分化相关的细胞外基质及蛋白多糖的表达。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/12在武汉协和医院中心实验室完成。材料:雄性昆明种小鼠20只,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。生长分化因子5真核表达质粒pcDNA3.1(+)/生长分化因子5为自备。方法:全骨髓贴壁法体外分离培养小鼠骨髓基质干细胞,取传至第3代细胞接种到6孔板,在细胞生长到90%融合时开始转染。设立3组:转染组采用LipofectamineTM2000进行脂质体介导pcDNA3.1(+)/生长分化因子5重组质粒瞬时转染;空质粒组转染空质粒pcDNA3.1(+);空白对照组只加入等量脂质体,其余步骤相同。主要观察指标:转染后72h通过RT-PCR及免疫细胞化学检测生长分化因子5基因与蛋白的表达鉴定转染是否成功,同法检测软骨基质Ⅱ型胶原的表达,转染后14d阿尔辛蓝染色检测蛋白聚糖的表达。结果:转染组有一大小为219bp的特异性扩增条带,骨髓基质干细胞胞浆内呈棕色阳性染色;而空质粒组、空白对照组均未发生生长分化因子5基因转录,无特异性扩增条带,且细胞胞浆未见明显染色。转染组可检测到Ⅱ型胶原基因的表达,基因大小225bp,Ⅱ型胶原细胞胞浆中可见棕黄色染色;空质粒组、空白对照组均未检测到Ⅱ型胶原基因的表达,SP染色均无明显染色。阿尔辛蓝染色后转染组细胞呈蓝染,空质粒组、空白对照组均未见明显异染性着色。结论:pcDNA3.1(+)/生长分化因子5转染骨髓基质干细胞能显著增加Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达,促进骨髓基质干细胞向软骨细胞方向分化。
- 刘之川邵增务邓超丁凡郭兵张宇坤
- 关键词：生长分化因子5软骨分化质粒
- 慢病毒介导C-1—1基因维持“自组装”工程化软骨永久性表型的研究
- 2012年
- 目的观察慢病毒介导C-1—1基因对维持“自组装”工程化软骨永久性表型的影响。方法构建携带C-1-1基因的重组慢病毒表达载体并转染成人骨髓间充质干细胞（hMSCs），用嘌呤霉素筛选获得阳性细胞。逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和免疫印迹试验（Westernblot）观察C-1—1基因的表达效果。用含有生长分化因子-5（GDF-5）的成软骨培养基诱导培养3周，3周后重悬细胞，以5×10^9个／L的细胞终质量浓度接种于2％琼脂糖包被的24孔板，行自组装培养3周后取材。通过Ⅱ型、x型胶原免疫组织化学，甲苯胺蓝染色鉴定分化结果，并与空载体转染组和未转染组比较。结果测序证实成功构建携带C-1-1基因的重组慢病毒表达载体，转染hMSCs后，C-1—1基因在转录水平和翻译水平都有明显表达。自组装培养3周后，3组标本经甲苯胺蓝染色均可见广泛蓝染并带有异染型着色。C-1-1基因转染组的Ⅱ型胶原平均吸光度（A）值为（0．3754±0．0255），与空载体转染组和未转染组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）；X型胶原平均A值为（0．0115±0．0062），显著低于空载体转染组和未转染组（P〈0．01）。结论慢病毒介导C-1—1基因转染后，可增强“自组装”工程化软骨表型的稳定性，抑制其成熟肥大。
- 孙志博杨述华张宇坤张波
- 关键词：软骨基因转染生长分化因子-5
- CDMP-1促进成人骨髓间充质干细胞成软骨分化的研究被引量：6
- 2011年
- 目的探讨软骨源性形态发生蛋白1(CDMP-1)诱导成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)向软骨细胞分化的可行性及最佳诱导浓度。方法分离培养BMSCs,免疫荧光法检测BMSCs表面CD34,CD45,CD105表达。采用含0、10、50、100 ng/ml CDMP-1的软骨诱导液诱导培养BMSCs 21 d,倒置显微镜观察细胞形态变化;RT-PCR检测不同浓度CDMP-1组细胞Ⅱ型胶原和Aggrecan表达;免疫组化检测Ⅱ型胶原表达;番红O和阿利新蓝染色检测蛋白多糖表达。结果成人BMSCs呈梭形漩涡状生长,CD44、CD105表达阳性,CD34呈阴性表达。CDMP-1诱导7 d后细胞形态逐渐由长梭形向多边形、多角形转化。不同浓度CDMP-1诱导21 d,Ⅱ型胶原表达量各组间差异均具有统计学意义(P<0.05);Aggrecan的表达CM组和10 ng组之间差异无统计学意义(P>0.05),其他各组间差异均具有统计学意义(P<0.05)。免疫组化检测Ⅱ型胶原表达阳性,阿利新蓝和番红O染色均为阳性。结论含100 ng/ml CDMP-1软骨诱导液能有效促进成人BMSCs向软骨表型分化。
- 张波杨述华张宇坤夏天孙志博
- 关键词：骨髓基质干细胞软骨细胞分化
- 骨组织细胞外泌体对骨代谢作用的研究现状被引量：3
- 2018年
- 骨质疏松症是老年人的常见病和多发病,骨组织来源细胞可分泌外泌体,包装和运载多种活性物质,如蛋白质、miRNAs、各种活性因子等,进行细胞间物质交换和信息交流,根据骨组织来源细胞外泌体和内容物的特点,利用其调节骨形成和骨吸收平衡的作用,甚至作为生物或基因治疗的载体,为老年骨质疏松症的防治提供全新的思路。
- 吴石磊刘勇邵增务田青
- 关键词：骨质疏松症外泌体骨生成骨吸收
- 缝隙连接阻断剂1-庚醇对构建'自组装'工程化软骨的影响
- 目的 探索缝隙连接阻断剂1-庚醇对生长分化因子-5 (growth differentiation factor 5,GDF-5)诱导人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal ste...
- 张宇坤杨述华孙志博张波许伟华叶树楠
- 关键词：自组装生长分化因子5缝隙连接蛋白43
