湖南省科技计划项目(2013SK3048)
- 作品数：4 被引量：4H指数：1
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- 相关机构：中南大学湘雅二医院中南大学更多>>
- 发文基金：湖南省科技计划项目湖南省卫生厅科研基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 金黄色葡萄球菌肠毒素C3过表达慢病毒载体的构建及鉴定
- 2016年
- 目的：构建金黄色葡萄球菌肠毒素C3（SEC3）过表达慢病毒载体并体外检测其表达目的基因。方法：聚合酶链反应（PCR）扩增SEC3基因片段;用Age I酶切线性化GV365慢病毒载体,通过连接反应构建GV365-SEC3载体,运用PCR方法鉴定阳性克隆载体;转染293T细胞包装慢病毒,观察细胞荧光及Western blot检测慢病毒载体表达,HIV-1 p24 ELISA法测定慢病毒载体滴度。结果：获得目的基因,并成功构建GV365-SEC3慢病毒载体,通过PCR及DNA测序鉴定,证明GV365-SEC3质粒构建正确;转染293T细胞后可观察到大量荧光细胞,经蛋白电泳得到29 k D大小的蛋白条带,与目的基因蛋白相符合,ELISA检测病毒载体滴度为5×10~8TU/ml。结论：成功构建GV365-SEC3过表达慢病毒载体,为后期研究其体内外对抗肿瘤的作用与机制奠定基础。
- 谢益欣王敏李先平杨敏李碰玲张婷婷宋欢董智慧唐爱国
- 关键词：慢病毒过表达
- 金黄色葡萄球菌肠毒素SEC3抑制剂的筛选及活性鉴定被引量：1
- 2014年
- 目的从噬菌体随机12肽库中筛选出金黄色葡萄球菌SEC3抑制剂并鉴定其活性。方法用纯化的重组的金黄色葡萄球菌SEC3包被酶标板,按吸附-洗脱-扩增的淘洗过程对噬菌体随机12肽库进行3轮筛选;用竞争ELISA法观察单个噬菌体克隆的竞争抑制效应,评价其活性。结果噬菌体3轮筛选的投入产出比逐轮升高,回收率从4.5×10-6升高至6.3×10-4,升高140倍,提示具有良好的富集效果;与阴性对照（未加噬菌体）相比,随机挑选的8个噬菌体克隆（A1~A8）竞争抑制率为10.6%~38.3%,差异有统计学意义（t值为9.0~23.5,P〈0.05）,其中A1平均竞争抑制率最高,为（30.5±7.4）%,A5的平均竞争抑制率最小,为（16.4±4.7）%。以噬菌体滴度对数值为x轴,以克隆噬菌体各滴度对应的平均竞争抑制率为y轴,绘制竞争抑制曲线,其回归方程为Y=2.7943X-4.7733,相关系数r=0.935,决定系数R2=0.8727。在噬菌体滴度在108~1012pfu范围内,随着噬菌体滴度的增高,其抑制率也增高,且克隆噬菌体滴度在1011pf或1012pfu的竞争抑制率最高。结论用纯化的SEC3从噬菌体随机12肽库中筛选的SEC3抑制剂具有一定的竞争抑制活性,而且竞争抑制活性随着噬菌体滴度的增高而增强。
- 王敏郑荣黄珍李先平张婷婷曹虹
- 关键词：金黄色葡萄球菌肠毒素抑制剂噬菌体随机肽库
- 金黄色葡萄球菌肠毒素C3单克隆抗体的制备与鉴定被引量：3
- 2014年
- 目的制备稳定分泌抗金黄色葡萄球菌肠毒素C3(SEC3)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的性质进行鉴定。方法以SEC3重组蛋白免疫Balb/c小鼠,应用细胞融合技术将小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA法检测筛选及2次有限稀释法克隆化培养,获得目的杂交瘤细胞株,并对其所产生的单克隆抗体进行效价、亲和常数及抗原识别表位等相关性质的鉴定。结果最终获得了两株能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞1C12和2A2,两者细胞培养上清的效价分别为1∶3 200和1∶1 600。经分析可知1C12细胞株的亲和力高于2A2细胞株,同时相加实验表明两个单克隆抗体识别抗原表位相同。结论单克隆抗体制备成功,为进一步完善肠毒素SEC3的临床检测奠定了基础。
- 王敏马瑞玉李先平郑荣张婷婷曹虹
- 关键词：金黄色葡萄球菌单克隆抗体间接ELISA
- 内皮抑素过表达慢病毒载体的构建及其鉴定
- 2016年
- 目的构建内皮抑素（endostatin,ES）过表达慢病毒载体,并进行鉴定。方法利用载体PUC57-ES构建GV365-ES慢病毒载体,转染293T细胞包装慢病毒,荧光显微镜下观察绿色荧光;Western blot法鉴定表达的目的蛋白;HIV-1 ELISA法检测病毒滴度。结果经PCR及测序鉴定证明慢病毒载体GV365-ES构建正确;转染细胞中荧光显微镜下可见绿色荧光,表达的目的蛋白相对分子质量约23 000;病毒滴度为2.1×10^8 TU/ml。结论已成功构建ES过表达慢病毒载体,为后期该病毒载体治疗实体瘤的观察及其作用机理的研究奠定了基础。
- 杨敏王敏李先平谢益欣李碰玲张婷婷宋欢董智慧
- 关键词：内皮抑素慢病毒
