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辽宁省教育厅基金资助项目(L2010290)
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王月田
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软骨源性形态发生蛋白1转基因细胞片的初步探讨
2014年
目的探讨软骨源性形态发生蛋白1(cartilage.derivedmorphogeneticprotein1,CDMPl)转基因细胞片的构建及其活性鉴定。方法取1月龄新西兰白兔骨髓分离培养BMSCs,取第3~6代细胞进行实验。实验分为3组,A组:腺病毒(adenovirus,Ad).巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)-人CDMP1(humanCDMPl,hCDMP1)-内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite,IRES).增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)转染BMSCs,B组:Ad-CMV-EGFP(空载体腺病毒)转染BMSCs,C组:未转染的BMSCs。倒置荧光显微镜观察3组细胞荧光表达情况,MTT法检测3组细胞增殖活力。将3组处于对数生长期的细胞接种于温度敏感性6孔板获得细胞片,行形态学及HE染色观察,RT-PCR及Westemblot检测3组细胞片hCDMP1和II型胶原mRNA及蛋白表达,阿利新蓝染色检测糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAG)表达。结果倒置荧光显微镜下观察示转染细胞在72h表达明亮荧光,转染效率达90%;MTT法检测示,3组细胞生长曲线基本呈S形,培养1~9d吸光度(A)值比较差异均无统计学意义(P〉0.05)。通过温度敏感性6孔板体外可成功收获完整的三维立体细胞片结构,RT-PCR及Westemblot检测示,A组细胞片中hCDMP1和II型胶原mRNA及蛋白均呈阳性表达,B、C组均为阴性。HE染色和阿利新蓝染色示,A组纤维组织丰富,细胞外基质较多,蓝色异染颗粒多;B、C组细胞外基质相对较少,无明显特异性蓝染颗粒;A组GAG阳性染色面积明显低于B、C组,灰度值明显高于B、C组(P〈0.05)。结论hCDMPl基因转染的BMSCs细胞片能表达II型胶原和GAG,具有成软骨活性,其克服了传统组织工程中细胞利用率低、支架异质性等缺点,有望构建出致密的组织工程软骨,为软骨组织工程进一步发展提供了新思路。
姚梅
崔颖
王月田
张本
付文举
关键词:
软骨组织工程
BMSCS
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