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体外转录法制备登革热1-4型病毒RNA片段: 2010年; 目的通过体外转录获得登革热1-4型病毒保守区基因的RNA片段,为核酸快速检测方法的建立和改进提供阳性定量标准品。方法设计登革热1-4型病毒基因保守区克隆引物,RT-PCR从病毒RNA获得相应片段,分别连接至质粒PGEM-T-easy上并筛选阳性重组质粒,测序鉴定后酶切线性化,用T7 RNA聚合酶进行体外转录,得到固定长度的RNA片段,DNase酶处理后测定浓度,梯度稀释后用RT-PCR验证。结果获得含登革热1-4型病毒靶基因序列的准确定量拷贝数的RNA片段,质量浓度分别为352.6 ng/μl、384.2 ng/μl、457.3 ng/μl、368.7 ng/μl,RT-PCR验证均扩增出相应目的条带。结论获得的RNA片段可作为登革热1-4型病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品。; 张锦海王忠灿吕恒顾海涛王平鲁娟东王长军; 关键词：登革热病毒克隆 T7启动子体外转录

H5N1禽流感病毒抗原基因的体外转录及RNA标准品构建被引量：6: 2011年; 目的通过基因克隆和体外转录,获得H5N1禽流感病毒血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白M(M)基因的RNA片段,为病原学检测提供阳性定量标准品。方法设计H5N1禽流感病毒的HA、NA及M基因全长开放阅读框的克隆引物,提取H5N1禽流感病毒总RNA,用RT-PCR获得相应片段,分别连接至pGEM-Teasy质粒,转化宿主菌XL10-Gold,然后提取阳性克隆的重组质粒DNA,测序鉴定后用限制性核酸内切酶NdeI酶切线性化,用T7RNA聚合酶进行体外转录,产物用DNase酶处理、纯化后测定浓度,用实时荧光定量PCR构建标准曲线进行验证。结果获得含H5N1禽流感病毒HA、NA、M基因全长开放阅读框序列的准确定量拷贝数的RNA片段,质量浓度分别为503.9、379.2、437.8ng/μl。结论获得的RNA片段可作为H5N1禽流感病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品。; 张锦海王忠灿郑纪山吕恒鲁娟东顾海涛王平王长军; 关键词：克隆体外转录

上海世博会“反生物恐怖袭击”医学救援的做法与启示被引量：2: 2012年; 目的总结上海世博会"反生物恐怖袭击"医学救援安保工作的经验,为今后做好类似重大活动的安保工作提供借鉴。方法对上海世博会安全保卫的"反生物恐怖袭击"医学救援工作进行回顾性总结。结果总结出4点主要做法:(1)准确理解任务,分析恐怖袭击形式和特点;(2)研究制定科学处置预案;(3)科学编组,认真组织训练;(4)缜密力量部署。并提出4点启示:一是提升医学救援队的指挥协调能力;二是完善医学救援应急预案;三是加强专业技术装备建设,提升快速检测能力;四是加强生物恐怖病原相关的基础研究和防治研究。结论生物恐怖袭击形势日趋严峻,必须进一步健全"反生物恐怖袭击"医学救援体系,以便更好地保障类似的国家重大活动顺利进行。; 吕恒张锦海王长军; 关键词：世博会医学救援

禽流感病毒H5N1抗原基因克隆及体外转录被引量：3: 2010年; 目的通过基因克隆和体外转录,获得H5N1禽流感病毒抗原基因的RNA全长片段,为病原学检测提供阳性定量标准品。方法设计H5N1禽流感病毒血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)及基质蛋白M(M)的基因克隆引物,RT-PCR从病毒RNA获得相应片段,分别连接至pGEM-T Easy质粒并筛选阳性重组质粒,测序鉴定后酶切线性化,用T7 RNA聚合酶进行体外转录,产物用DNase酶处理、纯化后测定浓度,RT-PCR验证。结果获得含H5N1禽流感病毒HA、NA、M全长基因序列的RNA片段,并可准确定量其拷贝数,质量浓度HA为503.9 ng/μL、NA为379.2 ng/μL、M为437.8 ng/μL。结论获得的RNA片段可作为H5N1禽流感病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品。; 张锦海王忠灿郑纪山王平鲁娟东吕恒王长军; 关键词：禽流感病毒 H5N1亚型克隆体外转录

烈性呼吸道细菌多重荧光PCR检测方法建立被引量：2: 2011年; 目的建立多重实时荧光PCR检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌的方法。方法设计分别针对炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌毒力因子基因和特异性结构基因的引物和荧光双标记探针,优化反应体系,建立2套均可同时检测3种细菌的多重实时荧光PCR方法,以及3种分别针对上述单一细菌的二重实时荧光定量PCR方法。结果构建的多重和二重实时荧光PCR方法,检测敏感性分别达到100模板拷贝每反应和20模板拷贝每反应,并且高浓度模板对低浓度模板的扩增检测干扰不明显,对阳性菌株均100%检出,对常见杆菌检测均为阴性。结论多重实时荧光定量PCR具有可以同时筛查、经济、快速、特异性强、灵敏度好等优点,在炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌的病原体检测方面有较大应用价值。; 张锦海陈文琦朱进吕恒顾海涛王平鲁娟东王长军; 关键词：炭疽杆菌鼠疫耶尔森菌嗜肺军团菌

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南京军区面上课题(08MB149)