山东省医药卫生科技发展计划项目(2009HW087)
- 作品数：6 被引量：1H指数：1
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- HPV16-E7 H2P融合钙网蛋白基因重组腺病毒载体疫苗的构建与免疫学鉴定被引量：1
- 2012年
- 目的构建表达钙网蛋白(CRT)与乳头瘤病毒16型E7基因H2P突变型(HPV16-E7 H2P)融合蛋白重组腺病毒载体(Ad-CRT/HPV16-E7 H2P),为研发新型乳头瘤病毒治疗性疫苗奠定基础。方法首先利用RT-PCR的方法扩增CRT基因,并进一步构建CRT与HPV16-E7 H2P基因融合重组的pJW4303表达载体,将目的基因加上特定的CACC接头后克隆入载体pENTR/D-TOPO以获得入门克隆。经过入门克隆与表达载体(pAd-CMV/V5-DEST)间的重组反应获得表达克隆Ad-CRT/HPV16-E7 H2P。表达克隆线性化后转染HEK293A包装细胞,得到重组腺病毒。结果构建的Ad-CRT/HPV16-E7 H2P经PCR和测序鉴定构建正确;转染HEK293A细胞并扩增后获得的病毒滴度为1.95×1011 pfu/mL,该重组病毒载体能正确表达CRT/HPV16-E7 H2P融合蛋白。结论成功构建了Ad-CRT/HPV16-E7 H2P。
- 刘瑞林马永臻张永东马春玲
- 关键词：钙网蛋白乳头瘤病毒腺病毒表达载体治疗性疫苗
- 腺病毒载体的优化研究现状
- 2010年
- 本文简要综述腺病毒载体的研究现状，包括各型载体的构成、优势与缺陷，及其相应的优化策略，并指出在我国人群中腺病毒载体作为疫苗和基因治疗的工具所应采取的优化措施。
- 马春玲
- 关键词：腺病毒载体恶性肿瘤基因治疗
- CRT180基因重组腺病毒载体的构建与鉴定
- 2010年
- 目的构建表达CRT180基因重组的腺病毒载体，为肿瘤的基因治疗奠定实验基础。方法采用腺病毒表达系统（Vira Power^TM Adenoviral Expression System）构建重组腺病毒表达载体。首先利用RT-PCR的方法在人肺腺癌细胞系A549细胞中扩增CRT180基因，以连接、转化等方法克隆入载体pENTR／D—TOPO以获得重组的入门克隆，经测序及PCR鉴定正确后，用重组酶（LRClonase^TMⅡ Enzyme Mix）进行入门克隆与腺病毒表达载体（pAd—CMV／V5-DEST）间的重组反应，以获得表达克隆（rAd．CRT180）质粒。重组表达克隆鉴定后，用限制性内切酶PacⅠ是使之线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒。用极限稀释法检测病毒滴度用Western Blot法检测rAd．CRT180载体是否能正确表达CRT180蛋白。结果用RT-PCR的方法扩增到CRT180基因；重组入门和表达克隆经酶切和PCR鉴定构建正确，重组表达克隆转染HEK293A细胞获得病毒原液并扩增后测定病毒滴度为1．8×10^11pfu／mL，且这个病毒能正确表达CRT180蛋白。结论成功构建了CRT180基因的重组腺病毒载体，可为此重组载体用于肿瘤基因治疗提供实验依据。
- 马春玲孙运芳姚伟马永臻于立玲
- 关键词：钙网蛋白重组腺病毒载体肿瘤基因治疗克隆包装细胞
- 钙网蛋白融合HBsAg基因重组腺病毒新型载体疫苗的构建与鉴定
- 2011年
- 目的:构建表达钙网蛋白(calreticulin,CRT)与乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)融合基因重组腺病毒载体(Ad-CRT/HBsAg),为研发新型乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)治疗性疫苗奠定基础。方法:采用腺病毒表达系统(ViraPowerTM Adenoviral Expression System)构建重组腺病毒表达载体。首先利用RT-PCR的方法扩增CRT基因,并进一步构建CRT与HBsAg基因融合重组的pJW4303表达载体,在构建过程中给融合基因加上特定的CACC接头,再克隆入载体pEN-TR/D-TOPO以获得入门克隆,经PCR及测序鉴定正确后,用重组酶(LR ClonaseTMⅡEnzyme Mix)进行入门克隆与表达载体(pAd-CMV/V5-DEST)间的重组反应,以获得表达克隆Ad-CRT/HBsAg。表达克隆鉴定后,用限制性内切酶PacⅠ线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒。经过扩增后,用极限稀释法检测病毒滴度,用Western blot法检测Ad-CRT/HBsAg载体是否能正确表达目的蛋白。结果:构建的含有CRT/HBsAg融合基因的腺病毒表达克隆,经PCR和测序鉴定构建正确。重组表达克隆转染HEK293A细胞并扩增,获得的病毒滴度为2.68×1011 pfu/ml,且这个重组病毒载体能正确表达CRT/HBsAg融合蛋白。结论:成功构建了CRT/HBsAg融合基因重组腺病毒载体(rAd-CRT/HBsAg),为此重组载体用于治疗HBV慢性感染以及HBsAg阳性肝癌奠定基础。
- 张兰春王宝红王芳马春玲
- 关键词：钙网蛋白乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒表面抗原腺病毒表达载体治疗性疫苗
- CRTl80基因重组腺病毒载体的构建与鉴定
- 2010年
- 目的构建表达CRT180基因重组的腺病毒载体，为肿瘤的基因治疗奠定实验基础。方法采用腺病毒表达系统（Vira Power Adenoviral Expression System）构建重组腺病毒表达载体。首先利用RT-PCR的方法在人肺腺癌细胞系A549细胞中扩增CRT180基因，以连接、转化等方法克隆入载体pENTR／D-TOPO以获得重组的入门克隆，经测序及PCR鉴定正确后，用重组酶（LR Clonase Ⅱ Enzyme Mix）进行入门克隆与腺病毒表达载体（pAd-CMV／V5-DEST）间的重组反应，以获得表达克隆（rAd—CRT180）质粒。重组表达克隆鉴定后，用限制性内切酶PacI是使之线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒。用极限稀释法检测病毒滴度用Western Blot法检测rAd-CRT180载体是否能正确表达CRTl80蛋白。结果用RT-PCR的方法扩增到CRT180基因；重组入门和表达克隆经酶切和PCR鉴定构建正确，重组表达克隆转染HEK293A细胞获得病毒原液并扩增后测定病毒滴度为1．8×10^11pfu／mL，且这个病毒能正确表达CRT180蛋白。结论成功构建了CRTl80基因的重组腺病毒载体，可为此重组载体用于肿瘤基因治疗提供实验依据。
- 马春玲孙运芳姚伟马永臻于立玲
- 关键词：钙网蛋白重组腺病毒载体肿瘤基因治疗克隆包装细胞
- 腺病毒载体的优化研究现状
- 2010年
- 本文简要综述腺病毒载体的研究现状，包括各型载体的构成、优势与缺陷，及其相应的优化策略，并指出在我国人群中腺病毒载体作为疫苗和基因治疗的工具所应采取的优化措施。
- 马春玲
- 关键词：腺病毒载体
