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双链RNA干扰技术在毛状根体系中对何首乌芪合酶基因Fm STS功能研究中的应用被引量：2: 2012年; [目的]将双链RNA介导的基因沉默与发根农杆菌瞬间表达渗入相结合,为植物功能基因的研究提供一套有效的方法。[方法]构建含gfp基因、CaMV 35S启动子及基于何首乌中芪合酶Fm STS基因序列设计的双链RNA的干扰重组质粒pBIN-35S-正向-反向-GFP(干扰),并将其与空白表达质粒pBIN-35S-GFP(空白)分别导入野生型发根农杆菌MSU440中,转化何首乌无菌苗的叶片,诱导生成毛状根。[结果]双链RNA介导的芪合酶Fm STS基因表达沉默,空白对照组二苯乙烯苷含量为2.18 mg/g,是双链RNA干扰组(0.65 mg/g)的3倍多。[结论]应用dsRNA介导的RNAi能有效沉默何首乌Fm STS基因,芪合酶Fm STS基因是何首乌中二苯乙烯苷合成代谢的关键酶基因。; 朱宽鹏夏晚霞赵树进; 关键词：DSRNA 何首乌毛状根次级代谢

何首乌研究现状被引量：4: 2014年; 何首乌为我国传统中医常用的滋补名药,国内外对其研究主要集中在对其特异性进行区分鉴定、进行组织培养、毛状根培养、化学成分拆分、药理作用研究、主要成分代谢路经研究等几个方面,从这些方面对何首乌研究现状进行综述。; 赵炜赵树进; 关键词：何首乌药理作用二苯乙烯苷

mRNA差异显示技术筛选何首乌中二苯乙烯苷合成相关基因被引量：1: 2014年; 【目的】筛选和克隆何首乌中二苯乙烯苷代谢相关酶基因。【方法】采用mRNA差异显示技术,对何首乌中二苯乙烯苷含量差异悬殊的不同组织(根、茎、叶)进行差异表达基因的筛选,将得到的差异基因连接pMD19-T载体进行测序后,通过数据库比对预测其基因功能。【结果】发现差异片段51条,选取其中9条进行半定量PCR验证,获得3条阳性差异片段。其中1条阳性片段为何首乌茎和叶特异表达,与甘氨酸脱氢酶高度同源,另外2条阳性片段为何首乌块根特异表达,分别与烯酰辅酶A水合酶、氨基肽酶N高度同源。【结论】通过mRNA差异显示技术得到的3个同源序列可为进一步研究何首乌中二苯乙烯苷生物合成途径提供帮助。; 黎洁文赵炜赵树进; 关键词：何首乌二苯乙烯苷 MRNA差异显示基因表达差异

生物催化法研究何首乌二苯乙烯苷生物合成途径中的聚酮反应: 2015年; 目的：利用生物催化法研究中药何首乌活性成分二苯乙烯苷生物合成途径中的聚酮反应。方法：以丙二酰辅酶A和4-香豆酰辅酶A为底物,利用何首乌愈伤组织粗酶进行体外酶催化,采用高效液相色谱和液质联用方法检测催化产物,硫酸铵盐析法和SDS-PAGE对不同组分的粗酶进行分析。结果：生物催化产物和白藜芦醇对照品的色谱峰保留时间均为23 min;在负离子模式下,催化产物质谱图的质荷比为227,与白藜芦醇对照品相吻合;硫酸铵盐析结果显示盐析梯度为40%~70%沉淀的粗酶具有催化活性,并且梯度为50%~60%沉淀的粗酶活性最高,不同硫酸铵盐析梯度沉淀的蛋白SDS-PAGE图谱条带差异较大,梯度为50%~60%沉淀的蛋白中发现分子量约42 k Da的条带,与芪合酶分子量一致。结论：何首乌二苯乙烯苷生物合成途径中聚酮反应的产物为白藜芦醇,并非二苯乙烯苷,从而推测二苯乙烯苷可能是由白藜芦醇转化而来,并非聚酮反应的直接产物。; 雷蕾夏晚霞邵利赵树进; 关键词：生物催化二苯乙烯苷白藜芦醇

基于条形码ITS2序列的何首乌及其近缘种和混淆品的分子鉴别被引量：5: 2015年; 目的:通过内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)序列分析,探究鉴别何首乌与其近缘种和混淆品的新方法。方法:何首乌与其近缘种和混淆品的ITS2序列进行扩增、纯化、测序,运用Seqman软件进行序列拼接,通过MEGA6.0软件进行序列的分析并构建kimura 2-parameter(K2P)模型的neighbor-joinin(NJ)系统聚类树。结果:何首乌与其近缘种和混淆品ITS2序列间存在明显差异,种内遗传距离小于种间遗传距离。齿叶蓼与何首乌种间遗传距离较大,却与翼蓼非常接近,二者的遗传距离仅0.029。NJ系统聚类树显示不同产地的何首乌聚为一支,与其近缘种和混淆品可很好地区分。结论:ITS2序列可有效地鉴别何首乌与其近缘种和混淆品,为何首乌的用药安全性提供技术保障。; 黎洁文赵树进; 关键词：何首乌混淆品聚类分析

何首乌不同部位二苯乙烯苷含量以及芪合酶FM-STS时空表达差异被引量：1: 2012年; 目的:探究何首乌不同部位主要有效成分二苯乙烯苷含量差异以及相对应部位何首乌芪合酶基因FM-STS表达差异。方法:通过液氮碾磨提取广东德庆同一株何首乌根茎叶中的RNA以及用50%稀乙醇过夜浸提芪合物二苯乙烯苷;使用乙腈和水为流动相(体积比为20∶80),利用高效液相色谱分析其二苯乙烯苷含量差异;采用实时荧光定量PCR分析芪合酶基因Fm-STS表达差异,以β-actin作为内参对照,2-△△CT公式计算各组别中FM-STS的含量。结果:根茎叶中芪合物二苯乙烯苷含量依次为14.62mg/g、1.78mg/g和0.47mg/g(干重),在mRNA水平上检测基因Fm-STS表达量为叶片中最高,根是叶的1/10倍,茎是叶的1/64倍。结论:芪合酶基因FM-STS主要在何首乌叶片中表达,二苯乙烯苷主要在叶片中合成,进而转移到根块中富集。; 朱宽鹏生书晶赵炜陆娣夏晚霞赵树进; 关键词：何首乌二苯乙烯苷芪合酶基因荧光定量PCR

芪合酶基因Fm-STS在何首乌毛状根中的过量表达分析: 2013年; 目的:通过过量表达探究在何首乌中得到的芪合酶基因Fm-STS的功能。方法:由含CaMV 35S启动子驱动以及荧光标记蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因的植物转基因基础表达质粒pBIN-35S-GFP构建过量表达质粒pBIN-35S-STS-GFP(阳性),并同空白表达质粒pBIN-35S-GFP(空白)均导入野生型发根农杆菌ATCC15834中,转化何首乌外植体(无菌苗叶片),诱导生成毛状根并培养,对毛状根进行高效液相色谱分析芪合物二苯乙烯苷含量变化以及实时荧光定量检测基因Fm-STS表达差异。结果:在过表达组和空白组中毛状根中发根农杆菌Ri质粒中的rolB基因和外源基因GFP均有表达,芪合物二苯乙烯苷含量依次为4.67 mg/g和2.18 mg/g(干重),在mRNA水平上检测基因Fm-STS表达量:过表达组是空白组的2.41倍。结论:基因FM-STS是何首乌中芪合物二苯乙烯苷生物合成过程中的酶基因,过量表达在基因功能研究中有良好的应用。; 朱宽鹏生书晶赵炜陆娣夏晚霞赵树进; 关键词：何首乌毛状根荧光定量PCR

何首乌二苯乙烯苷含量差异性研究被引量：7: 2014年; 目的：为筛选二苯乙烯苷含量差异显著的何首乌样本,为通过mRNA水平筛选与二苯乙烯苷合成相关酶基因,研究二苯乙烯苷合成途径打下基础。方法：HPLC,流动相为乙腈∶水（25∶75）;柱温：27℃;流速：1.0mL.min-1;进样量：10μL;紫外检测波长：320nm;进样时间：10min。结果：线性回归方程：y=41.233x＋1.6644,R2=1。结论：对水浴和室温冷浸两种萃取方法的比较发现水浴40min和冷浸12h效果无明显差异;冷浸12h和冷浸30h无显著差异;不同产地何首乌块根二苯乙烯苷含量差异显著（6.4%～0.0011%）,同一产地何首乌含量差异亦存在明显差异（6.4%～1.5%）;同株何首乌不同组织二苯乙烯苷含量存在较大差异,依次是：根〉茎〉叶;新叶〉老叶;老藤〉新藤。; 赵炜朱宽鹏生书晶姚焱赵树进; 关键词：何首乌二苯乙烯苷 HPLC

芪合酶基因Fm-STS在何首乌毛状根中的过量表达及dsRNA干扰被引量：9: 2012年; 目的:建立一套探究植物基因功能的方法体系,验证由芪合酶基因保守序列通过RACE扩增技术在何首乌中得到的基因Fm-STS的功能。方法:由含CaMV 35S启动子驱动的gfp基因的植物转基因表达基础质粒pBIN-35S-GFP构建过表达质粒pBIN-35S-STS-GFP(阳性)和双链RNA干扰重组质粒pBIN-35S-正向-反向-GFP(阴性),并同空白表达质粒pBIN-35S-GFP(空白)均导入野生型发根农杆菌ATCC15834中,转化何首乌外植体,诱导生成毛状根并培养,对毛状根进行高效液相色谱分析以及实时荧光定量检测。结果:在过表达组、空白组和干扰组中毛状根中发根农杆菌Ri质粒中的rolB基因和外源基因gfp均有表达,高效液相色谱法分析芪合物二苯乙烯苷含量依次为4.67mg/g、2.18mg/g和0.65mg/g,在mRNA水平上测试荧光定量检测基因Fm-STS表达量:RNAi组是空白组的1/433.53,过表达组是空白组的2.41倍。结论:结果表明过量表达与双链RNA干扰相结合在植物基因功能研究中有良好的应用,何首乌中芪合酶Fm-STS是二苯乙烯苷主要的合成酶。; 朱宽鹏赵树进; 关键词：DSRNA 毛状根荧光定量PCR

miR-139在胃癌中的表达及抑制作用研究: 2016年; miR-139在结肠癌、肝癌、外周神经鞘瘤、食管鳞状细胞癌、胶质瘤、胃癌中低表达,表明其在上述各种肿瘤中起到重要作用。本研究旨在验证miR-139在胃癌组织中的表达情况,就其在胃癌发生发展中的作用机制进行初步研究。采用实时荧光定量RT-PCR分析胃癌和癌旁组织中miR-139的表达水平;运用生物信息学手段,预测miR-139靶基因,并采用RT-PCR和Western blot分别检测潜在的靶基因在胃癌组织中的mRNA表达和蛋白水平表达变化;将miR-139 mimics瞬时转染胃癌细胞AGS细胞系,RT-PCR检测靶基因的表达水平。对瞬时转染miR-139 mimics及inhibitors的AGS细胞系,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期变化,Tran swell实验检测细胞侵袭能力。结果:(1)miR-139在胃癌中低表达。(2)生物学预测ROCK2是miR-139的靶基因,其在胃癌组织中mRNA和蛋白高表达。(3)miR-139 mimics转染后,抑制ROCK2 mRNA表达。(4)miR-139对胃癌的抑制作用:MTT结果表明,miR-139可抑制胃癌细胞增殖。Tran swell实验提示miR-139可抑制细胞的侵袭,miR-139可能通过下调靶基因的表达抑制胃癌细胞的增殖、侵袭能力。; 王舰平许锋李脉赵树进; 关键词：胃癌 RT-PCR分析靶基因蛋白激酶2

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广东省科技计划工业攻关项目(00697862100303016)

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