国家自然科学基金(30800030)
- 作品数：8 被引量：31H指数：4
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- Rhodococcus sp．R04BphD催化C－C断裂的动力学分析
- 2013年
- 2-羟基-6-氧-6-苯基己-2,4-二烯酸水解酶(BphD)是一种多氯联苯微生物降解途径中的关键酶.本文通过紫外-可见光光谱分别对突变酶S110A和H265A催化过程中酶-底物复合物进行检测,同时利用停流光谱技术对BphD及其突变酶(S110A、H265A和W266A)催化底物2-羟基-6-氧-6-苯基己-2,4-二烯酸(HOPDA)前稳态动力学进行了研究.结果表明,在BphD催化C-C断裂过程中,产物2-羟基戊-2,4-二烯酸(HPD)迅速生成,其速率常数为22 S-1.底物的消耗(速率常数,220.22 S-1和80.3 S-1)及酶-底物复合物的变化(速率常数,555.56 S-1和66.4 S-1)表明该酶催化过程包括2个动力学阶段:快速底物酮基化作用和C-C键断裂过程.紫外-可见光光谱扫描结果显示,在突变酶S110A的催化过程中,酶-底物复合物在492 nm及510 nm处有最大光吸收,而在突变酶H265A催化中,却没有相似的光吸收,只是在480 nm产生1个新肩峰.BphD及其突变酶S110A、H265A和W266A动力学分析表明,Ser-110主要负责底物C-C键断裂;His-265负责底物由烯醇式向酮式转变,并且与Ser-110和Trp-266共同参与了随后的C-C键断裂过程.结果揭示,除了传统的催化三联体(Ser-110,Asp-237,His-265)外,Trp-266在该水解酶催化反应中也发挥非常重要的作用,这一发现丰富了C-C水解酶的反应动力学机制.
- 杨秀清高冲沈翀李鹏丽
- 关键词：色氨酸
- 苯酚降解菌DF51的分离鉴定、降解特性及其固定化的研究被引量：4
- 2009年
- 为了研究焦化废水污染土样中微生物的降解性能,作者特地从太原市郊焦化厂附近的污染土样中采样,以便从中加氧酶催化开环,表明菌株DF51兼有混浊红球菌(Rhodoccocus opacus R7)和红球菌PNAN5(Rhodoccocus sp.strain DF51)降解苯酚的途径。菌株DF51固定化试验表明,该菌的固定化细胞具有降解苯酚的潜在应用价值。
- 张谨华李鹏丽王婧人李彩虹杨秀清
- 关键词：苯酚降解固定化细胞
- Rhodococcus sp.R04细胞色素P450单加氧酶及CYP125A18与唑类药物的互作分析
- 2016年
- 红球菌(Rhodococcus sp.)R04基因组有15种细胞色素P450单加氧酶,其中CYP125A18与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和马红球菌(Rhodococcus equi)的CYP125有较高同源性。利用NCBI蛋白质数据库搜索同源序列,对Rhodococcus sp.R04的15种CYP450一级结构序列进行比对和系统发育分析;对CYP125A18基因进行了克隆表达,并用紫外分光光度法对蛋白质的光谱学特性以及与唑类药物互作情况进行分析。实验结果表明,Rhodococcus sp.R04 15种CYP450均含有保守的氨基酸序列和铁血红素催化中心。SDS-PAGE分析表明,CYP125A18分子量约为50 k D,CYP125A18还原态和CO结合后与CYP125A18氧化态的差示光谱表现为典型的CYP450光谱特性。CYP125A18与底物4-胆甾烯-3-酮结合后,血红素铁全部转变为高自旋状态;与唑类药物滴定后发生了II型光谱转变。解离常数表明,7种唑类药物与CYP125A18的亲和力由强到弱依次为酮康唑、益康唑、4-苯基咪唑、氟康唑、4-甲基-2-苯基咪唑、克霉唑、甲硝唑。上述发现对研究CYP125代谢胆固醇具有重要意义,同时为疾病耐药性研究及药物选择提供数据和理论支持。
- 杨秀清徐洋
- 关键词：唑类药物
- 色氨酸残基在碳-碳水解酶催化中的关键作用被引量：2
- 2012年
- 碳-碳水解酶(C-C水解酶)作为α/β水解酶超家族中的一员,负责催化环裂产物C-C键的断裂,该反应是细菌降解芳香族化合物途径中的关键步骤.为了解水解酶的催化特性,本文对该酶部分氨基酸进行了定点突变,并对突变体的动力学参数,化学修饰剂对突变体活性的影响以及突变体的二级结构进行了测定.各突变体的动力学参数特征为:突变体S110A,H265A和D237A的催化效率为野生型的1/104～1/103;突变体W85A和W219A催化效率分别为野生型的5/18和1/3,而同为色氨酸的突变体,W266A的催化效率只有野生型的1/104.化学修饰剂对突变体S110A,H265A,D237A和W266A的酶活性几乎没有影响;而对突变体W85A和W219A却有较大的影响,修饰后,其相对活性仅为对照的10%～30%.突变体的圆二色谱(CD谱)分析表明,与野生型相比,突变体的二级结构没有发生改变.证明了Ser110,Asp237,His265是2-羟基-6-氧-6-苯基己-2,4-二烯酸水解酶(HOPDA hydrolase,HOPDA水解酶)催化反应所必需的氨基酸,并提出了Trp266在催化反应中也同样起到了非常关键的作用.
- 杨秀清沈翀高冲
- 关键词：色氨酸定点突变化学修饰
- 红球菌-R04生物降解多卤代联苯的影响因素研究被引量：11
- 2010年
- 研究了不同取代元素以及取代元素的数量、位置等因素对Rhodococcus sp.R04降解多卤代联苯的影响.结果表明,联苯苯环第4位上的氢分别被氟、氯、溴以及甲基基团取代后降解率由高到低依次为4-FB>4-CB≥4-MB>4-BrB;当取代元素相同时,随着取代原子数目的增加,多卤代联苯降解率降低;当取代元素及取代原子数目相同时,不同位置的取代对卤代联苯的降解影响较大,特别是2,6位取代会强烈抑制关键酶对卤代联苯的催化降解,导致降解率降低.
- 杨秀清郑媛李鹏丽王婧人
- 关键词：RHODOCOCCUS降解
- Trametes sp.SQ01和Chaetomium sp.R01混合培养对四种染料的脱色被引量：6
- 2011年
- 利用本实验室新构建的白腐菌Trametes sp.SQ01和毛壳菌Chaetomium sp.R01混合培养体系,对刚果红、酸性红、橙黄G和溴酚蓝4种染料进行了脱色研究.结果表明,SQ01与R01混合培养所产生的锰过氧化物酶(MnP)酶活比菌株SQ01单独培养时提高了约5.5倍.菌株R01的接种量、接种时间对混合培养中MnP的酶活有很大影响,菌株R01接种量过多或过少,都会使混合培养产生的MnP酶活降低.随着R01接种时间的延迟,MnP酶活也逐渐降低.4种染料对SQ01与R01混合培养时MnP的酶活有抑制作用,酶活大约降低了40%～75%,其中,酸性红对MnP酶活的抑制作用最强.菌株SQ01与R01的混合培养对4种染料的脱色率高于SQ01单一菌株的脱色率,提高了约20%～50%.混合培养第3d,SQ01与R01混合培养体系对刚果红、酸性红、橙黄G和溴酚蓝的脱色率分别为90%、75%、76%、94%,而菌株SQ01单独培养时的脱色率分别只有75%、43%、41%、63%.染料的加入时间对脱色有影响,混合培养4d后加入染料的脱色率高于混合培养0d后加入染料的脱色率.在4种染料的脱色过程中,除了生物降解作用外,生物吸附也起着重要作用.混合培养对橙黄G、溴酚蓝和酸性红的生物吸附率分别为2%、5%和15%,而对刚果红的生物吸附率高达60%.利用真菌混合培养对染料进行脱色研究,其高效的脱色能力表明该混合培养体系在染料脱色处理方面有着广阔的应用前景.
- 杨秀清王婧人赵晓霞薛瑞
- 关键词：染料脱色生物吸附
- 耐过氧化氢的锰过氧化物酶对三苯甲烷类染料的脱色(英文)被引量：7
- 2013年
- 【目的】从一株白腐菌Trametes sp.SQ01中获得一种新型的锰过氧化物酶,探讨该酶的底物特异性和对过氧化氢的耐性,以及其对三苯甲烷类染料的脱色能力。【方法】通过丙酮沉淀和DEAE-cellulose 52柱层析法纯化锰过氧化物酶。利用UV-2010紫外可见分光光度法研究锰过氧化物酶对过氧化氢的耐性,同时,用紫外可见分光光度计对三苯甲烷类染料脱色效果进行分析。【结果】通过两步纯化,获得了均一性的锰过氧化物酶。该酶的最适pH和温度分别是4.5和70°C,在pH 3.0?8.0时,酶活相对稳定。该酶在二价锰离子存在下能够氧化2,6-二甲氧基苯酚、愈创木酚、2,2′-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)和过氧化氢等化合物,同时也能作用二价锰离子。在与这些底物反应中,最适底物为过氧化氢(Km为3.7μmmol/L)。该酶具有抗过氧化氢漂白能力,锰过氧化物酶与高浓度的过氧化氢(2.5 mmol/L)作用60 min后仍能保持70%的活性。在所测试的染料中,锰过氧化物酶对结晶紫的脱色率最高达到65.8%。二价锰离子和过氧化氢对锰过氧化物酶脱色能力的影响进行研究,与孔雀绿相比,锰离子和过氧化氢对活性艳蓝脱色的影响很小。【结论】Trametes sp.SQ01锰过氧化物酶对过氧化氢的耐受性,以及对三苯甲烷类染料的高效脱色能力表明该酶在染料脱色降解方面有着广阔的应用前景。
- 杨秀清李树仁沈翀王婧人
- 关键词：锰过氧化物酶过氧化氢染料脱色
- 一种pH和热稳定的联苯水解酶的纯化及其特征被引量：3
- 2010年
- 【目的】通过联苯水解酶的表达,纯化,化学修饰以及酶学性质研究,以期了解水解酶的结构和功能,为其定向改造,获得高效的和能够拓宽底物范围的新突变酶奠定基础。【方法】将水解酶基因在大肠杆菌BL21(Escherichia coli BL21)中进行异源表达,表达产物经离子交换层析以及凝胶层析后进行酶学特性研究,同时通过圆二色谱法对该酶二级结构与热稳定性之间的关系进行分析。【结果】经Q Sepharose和Sephacryl S-300两步纯化获得了电泳纯的联苯水解酶(biphenyl hydrolase,BphD),SDS-PAGE鉴定其单体为31 kDa,Sepharose 12凝胶柱层析分析其为四聚体。该酶最适反应温度和最适pH分别为80℃和9,在pH4-11的缓冲液中酶活相对稳定。该酶在60℃温浴1 h,酶活剩余90%,而在70℃温浴时,半衰期为1 h,是迄今为止在红球菌中报道的唯一一例热稳定性高的水解酶。圆二色谱显示该酶以α-helix占主导地位,当温度升高到70℃时,其二级结构发生了明显的变化,75℃和80℃时BphD的结构已经遭到严重的破坏。序列比对表明:Ser,His,Asp以及Trp残基在几种同源水解酶中相对保守。化学修饰表明Ser,His,Asp在R04水解酶催化底物水解过程中担任重要角色,Trp残基可能位于酶的活性中心,并作为关键氨基酸参与底物的水解过程。【结论】获得了电泳纯的BphD,其pH稳定性以及耐高温特性在同源水解酶中较为罕见,色氨酸关键氨基酸的地位也为进一步了解该酶转化底物的机制奠定了一定的基础。
- 杨秀清李鹏丽郑媛沈翀
- 关键词：热稳定性化学修饰
