广东省卫生厅资助课题(A2003484)
- 作品数：3 被引量：28H指数：2
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- 一种高效、快速的大肠杆菌感受态细胞制备及质粒转化方法被引量：22
- 2005年
- 目的:建立一种高效、快速的大肠杆菌感受态细胞制备及质粒转化的方法。方法:质粒DNA加入感受态细胞,经短暂冰浴和热休克后,直接涂布预热至37℃的平板。以大肠杆菌DH5α为受体菌,研究CaCl2溶液浓度、感受态细胞的存放时间、转化时间及转化后的培养时间等对质粒转化效率的影响。结果:以100 mmol/L CaCl2溶液制备感受态细胞,冰浴转化5 min,经42℃热休克作用90 s后直接涂平板筛选转化子,获得与常规转化方法相当的转化效率。CaCl2溶液浓度和感受态细胞的存放时间对转化效率有明显的影响,而转化时间和转化后的振荡培养时间对转化效率的影响不明显。结论:成功地建立了一种高效、快速的感受态细胞制备及质粒转化的方法。
- 李明才何韶衡
- 关键词：大肠杆菌质粒感受态细胞
- 人白细胞介素-10在大肠杆菌中的高效可溶性表达及一步纯化
- 2006年
- 目的:在大肠杆菌(E.coli)中表达和纯化人白细胞介素-10(IL-10)。方法:用PCR技术从质粒pH15C中扩增编码人IL-10成熟蛋白的cDNA序列,将其克隆到pET-44载体中,构建表达质粒pET-44-IL-10。用菌落PCR和限制性酶切鉴定重组质粒并进行序列分析。重组质粒转化E.coliRosettaBlue(DE3)表达含6×His的重组人IL-10蛋白。重组蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化。结果:RosettaBlue(DE3)经1 mmol/L IPTG诱导、25℃培养,表达的IL-10主要以可溶性形式存在,表达效率为26%。超声破菌后的可溶性上清经一步Ni-NTA亲和层析进行纯化,所得蛋白纯度大于95%。结论:成功地得到了重组人IL-10纯品。
- 李明才何韶衡
- 关键词：白细胞介素-10大肠杆菌可溶性蛋白纯化
- 重组人IL-29的原核表达、纯化及活性分析被引量：6
- 2006年
- 目的:在大肠杆菌中表达具有活性的重组人白细胞介素-29(IL-29).方法:用PCR技术扩增人IL-29成熟蛋白的编码序列,克隆入原核表达载体pET-44Ek/LIC中,构建融合表达载体pET-44Ek/LIC-IL-29,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达IL-29融合蛋白,经镍柱亲和层析纯化,然后用肠激酶消化除去N端融合标签得到完全天然状态的重组人IL-29,经N-端氨基酸测序鉴定纯化的IL-29,用细胞病变抑制法测定其活性.结果:成功构建了表达载体pET-44Ek/LIC-IL-29,DNA序列测定结果与预期结果一致.在30℃培养条件下,IPTG诱导表达的IL-29融合蛋白占菌体蛋白总量43%左右,并且大部分以可溶形式存在.纯化后的融合蛋白经肠激酶切割和回收后,所得目的蛋白(IL-29)纯度大于96%,该蛋白N-端序列与理论值一致,其抗病毒活性与IFN-α2b相当.结论:获得了具有生物学活性的重组人IL-29.
- 李明才何韶衡
- 关键词：大肠杆菌可溶性蛋白质纯化
