广东省自然科学基金(9151008901000083)
- 作品数：3 被引量：3H指数：1
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- 相关机构：中山大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广东省自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
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- 固有免疫调控蛋白PKR串联亲和纯化系统的建立及应用被引量：1
- 2011年
- 目的构建固有免疫调控蛋白——双链RNA（dsRNA）调控的蛋白激酶（PKR）的串联亲和纯化系统（TAP），初步研究PKR蛋白功能，以用于与PKR相互作用的新蛋白的鉴定与功能分析。方法通过PCR扩增PKR目的基因，克隆至真核表达载体pcTAP—A中。将重组质粒pcTAP-PKR通过脂质体法转染PKR稳定沉默（PKRkd）的HeLa细胞，并检测PKR对固有免疫信号通路之一，即促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）激活的调控；最后利用串联亲和纯化试剂盒纯化分离与PKR相互作用的蛋白，验证PKR蛋白复合物的纯化情况。结果将重组质粒pcTAP-PKR转染PKRkd HeLa细胞后，24h后即可检测到PKR融合蛋白，相对分子质量约为75×10^3，其表达量随着转染时间的增加而减少；PKR的过表达可发生自我磷酸化，并引起了MAPK信号通路的激活；Westernblot结果显示，小规模TAP纯化试验成功分离纯化了PKR蛋白。结论成功建立了一个PKR表达和串联亲和纯化系统，并证明PKR具有调控MAPK信号通路活性，为今后鉴定与PKR相互作用的蛋白研究奠定了基础。
- 李玉叶梁兆端吴思宇谢炯何军芳吴敏昊黄曦张萍
- 关键词：双链RNA亲和纯化
- 蛋白激酶PKR的克隆表达及与其相互作用的蛋白质的亲和纯化被引量：2
- 2012年
- 目的:克隆并表达双链RNA调节的蛋白激酶(PKR)基因,以纯化分离与PKR相互作用的蛋白质。方法:设计特异性引物,PCR扩增分别得到FLAG-PKR-HA和HA-PKR-FLAG基因片段,克隆至表达载体pSG5中。将重组质粒通过脂质体法转染PKR稳定沉默(PKRkd)的HeLa细胞,Western blot检测PKR及标签表达情况;最后,利用HA、FLAG串联亲和纯化系统(TAP)纯化分离与PKR相互作用的蛋白,Western blot技术及银染SDS-PAGE验证PKR蛋白复合物的纯化和分离情况。结果:成功构建了PKR融合蛋白表达载体及FLAG、HA亲和纯化系统,SDS-PAGE和银染结果显示TAP系统分离得到了PKR蛋白带和两条可能与PKR相互作用的蛋白质片段。结论:成功纯化和分离了与PKR相互作用的蛋白质,为进一步研究奠定了基础。
- 谢炯夏君张佩芬李玉叶吴敏昊黄曦张萍
- 关键词：PKR亲和纯化相互作用
- 双链RNA依赖性蛋白激酶及与其相互作用的蛋白质被引量：1
- 2012年
- 双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)是一个经典的干扰素可诱导蛋白,具有抗病毒活性,并参与了细胞信号转导、细胞生长、分化和凋亡等生理过程。此外,PKR在抗病毒的天然免疫应答中亦发挥着十分重要的调控作用。近来,越来越多的研究发现报道了与PKR相互作用的蛋白质,为阐明PKR功能的分子机制提供了重要依据。本文主要介绍了已被证实与PKR相互作用的蛋白质,并对PKR发挥作用的机制进行探讨。
- 谢炯夏君张佩芬张萍
- 关键词：PKR相互作用信号通路
