国家自然科学基金(30800014)
- 作品数：2 被引量：6H指数：1
- 相关作者：宋厚辉武晓林方维焕俞盈蔡潇浪更多>>
- 相关机构：浙江农林大学浙江大学浙江省疾病预防控制中心更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
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- 结核分枝杆菌同源重组基因敲除系统的构建和应用被引量：6
- 2012年
- 【目的】结核分枝杆菌同源重组效率很低,突变株的构建需要半年之久。本研究的目的在于构建一种用于在结核分枝杆菌中进行基因快速敲除、且易于筛选的高效同源重组系统。【方法】野生型结核分枝杆菌转化含有SacB反向选择标记、且能诱导表达两种同源重组酶gp60和gp61的质粒pSL002。然后分别将靶基因的两个同源臂克隆入到含有hyg(潮霉素)抗性基因和gfp(绿色荧光蛋白)基因的重组质粒pSL001中,再将靶基因同源臂-loxP-hyg-gfp-loxP片段从pSL001切下,转化含有pSL002的野生型结核分枝杆菌,一步得到双交换突变株。再将含有SacB反向选择标记、且表达Cre重组酶的质粒pSL003转化入结核分枝杆菌双交换突变株中,切除两个loxP之间的hyg抗性基因和gfp基因,得到无痕缺失突变株。最后利用含有2%蔗糖的琼脂糖平板去除含有SacB反向选择标记的质粒pSL002和pSL003。【结果】在结核分枝杆菌中成功构建了高效同源重组系统,利用该系统构建了rv1364c、pstP跨膜区、pstP胞外区三个突变株,得到双交换突变株的效率为25%-62.5%,从双交换突变株得到无痕缺失突变株的效率为100%。通过gfp作为荧光标记基因,利用NightSea BlueStar蓝光手电筒和滤光眼镜,可以对平板上的基因缺失株直接进行快速判定。【结论】该同源重组系统利用gp60和gp61重组酶,在时间上将在结核分枝杆菌中无痕缺失突变株的构建从6个月缩短到3个月。这是目前为止在结核分枝杆菌中构建突变株最快且效率最高的方法,为加速分枝杆菌功能基因组的研究提供了新的遗传工具。
- 武晓林方维焕俞盈宋厚辉
- 关键词：结核分枝杆菌同源重组基因敲除重组酶荧光标记
- 天冬酰胺酶介导的分枝杆菌酸适应机制
- 2012年
- 【目的】结核分枝杆菌可以在宿主细胞内的酸性环境中长期存活。为了探明天冬酰胺酶(AnsA)代谢通道介导的分枝杆菌在酸性环境中的适应机制,分别通过体内和体外实验,对AnsA的活性、突变体性质进行了分析。【方法】以无致病性的卡介苗分枝杆菌(M.bovis BCG)为模式菌,扩增天冬酰胺酶编码基因ansA并在大肠杆菌中进行表达和纯化,对AnsA的酶学活性进行了分析。在卡介苗分枝杆菌中将ansA敲除,对其抗酸、产氨等特性进行了研究。【结果】纯化的重组AnsA在体外可以将天冬酰胺分解并产生氨。在酸性培养基中,分枝杆菌利用天冬酰胺产生的氨,可以释放到培养基中,将酸性培养基中和。敲除ansA后,卡介苗分枝杆菌在酸性环境中的生长滞后10天左右。为了更好的理解天冬酰胺介导的抗酸机制,绘制了天冬酰胺代谢、氨产生和转运示意图。【结论】结核分枝杆菌的抗酸特性之一是通过分泌氨将周围的酸性环境中和来实现的。氨来源于分枝杆菌AnsA对底物天冬酰胺的分解。这为揭示结核分枝杆菌在宿主巨噬细胞内酸性环境中的生存机制提供了线索。
- 蔡潇浪吴蓓蓓方扬宋厚辉
- 关键词：天冬酰胺
