教育部“新世纪优秀人才支持计划”(NCET-04-0906NCET-06-0818)
- 作品数：28 被引量：161H指数：7
- 相关作者：汪铭书程安春陈孝跃朱德康周毅更多>>
- 相关机构：四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室四川大学更多>>
- 发文基金：教育部“新世纪优秀人才支持计划”四川省重点科学建设项目国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学轻工技术与工程更多>>
- 荧光定量PCR检测小鹅瘟病毒VP3基因疫苗在小鼠体内的动态分布
- 2008年
- 刘晓东程安春汪铭书韩新锋卢菲黎敏陈孝跃
- 关键词：小鹅瘟病毒荧光定量PCR检测基因疫苗VP3小鼠
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗的构建及其在Marc-145细胞中的表达被引量：5
- 2008年
- 根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)LV和VR-2332株的核苷酸序列,设计合成了1对特异性引物,对PRRSV四川分离株SC1和SC2进行RT-PCR,扩增出病毒ORF5基因。利用真核表达质粒pcDNA3.1(+)成功构建了PRRSV四川分离株ORF5基因疫苗pcDNA-PRRSV-SC1-ORF5和pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5。通过脂质体转染法和电穿孔转染法将pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5转染Marc-145细胞,间接免疫荧光技术跟踪监测ORF5基因的表达情况,结果表明,脂质体转染法和电穿孔转染法分别在转染26 h和23 h后检测到ORF5基因特异性表达产物,且随着培养时间的延长,特异性表达产物增多,两者均在56 h达到高峰;这证明pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5在Marc-145细胞中已高效表达,为PRRSV基因疫苗在临床上应用提供了实验依据。
- 希尼尼根程安春汪铭书陈希文豆文波李雪梅刘伍梅刘菲张平英陈孝跃
- 关键词：PRRSVORF5基因疫苗
- 用黄曲霉毒素B1单抗介导免疫组化法检测雏鸭感染黄曲霉毒素的分布规律研究被引量：6
- 2008年
- 【目的】(1)建立单抗介导的、能够对黄曲霉毒素AFB1进行亚细胞定位的免疫组化方法;(2)探明AFB1侵染和分布于雏鸭靶器官(细胞)规律,为阐明AFB1对雏鸭的致病机理提供基础实验数据,为AFB1感染人类提供研究模型。【方法】(1)利用AFB1单抗、免疫组化理论和方法,结合石蜡切片技术,建立检测感染雏鸭组织器官和细胞中AFB1方法;(2)7日龄樱桃谷鸭饲喂黄曲霉毒素(AFB1)含量为150μg·kg-1的全价饲料,分别于6、12、24、48、72、96、120、144、168和192h各剖杀2只,取心、肝、脾、肺、肾、脑、十二指肠、法氏囊、胸腺和胰腺等组织器官多聚甲醛固定、石蜡包埋,应用建立的单抗介导免疫组化对AFB1在感染雏鸭体内侵染的组织器官和细胞进行定位检测。【结果】(1)建立的单抗介导的免疫组化能够特异性检测到感染雏鸭组织中的AFB1,而对鸭病毒性肝炎病毒、鸭疫里默氏杆菌、鸭多杀性巴氏杆菌、鸭沙门氏菌和鸭大肠杆菌感染鸭组织呈现阴性反应;(2)雏鸭采食含AFB1饲料后,24h可在肝脏和肾脏中检测到AFB1,随后在脾脏(48h)、胰腺(96h)、十二指肠(120h)、心肌(144h)及法氏囊(168h)检测到AFB1,其中肝脏和肾脏的阳性结果最强;AFB1分布于肝脏肝窦及汇管区周围炎性反应带的肝细胞,肾脏肾小管、集合管上皮细胞以及肾小球毛细血管,脾脏白髓及炎性细胞,胰腺腺上皮细胞,十二指肠脱落的黏膜上皮细胞,心脏血管周围和心脏发生空泡变性的心肌纤维中;AFB1主要集中分布于细胞核内,而细胞膜和细胞浆内也有少量的分布。【结论】(1)单抗介导免疫组化能够特异检测AFB1感染雏鸭组织石蜡切片中的AFB1和亚细胞定位,还可用于AFB1感染雏鸭的实验室诊断和甲醛固定组织的回顾性诊断;(2)AFB1可广泛侵害感染雏鸭各个组织器官,以肝脏和肾脏最为严重。AFB1主要蓄积于被感染的细胞核。
- 程安春刘艳丽朱德康汪铭书胡骑陈孝跃
- 关键词：免疫组化黄曲霉毒素雏鸭
- 鸭瘟病毒TK基因的克隆及其分子特性分析被引量：17
- 2008年
- 通过测定动物疫病与人类健康四川省重点实验室构建的鸭瘟病毒(duck plaque virus,DPV)DNA基因文库中重组质粒的DNA序列,得到了该病毒胸苷激酶(TK)基因的ORF。采用PCR扩增出了DPV TK基因并将其克隆到pMD18-T载体上,之后对重组质粒进行了PCR和双酶切(BamHⅠ+HindⅢ)鉴定,并利用生物信息学软件Genscan、ProtScale、SignalP2.0、Scansite、TMpred、Prosite、DNAStar以及在线Predictprotein等分析了TK基因的分子特性。结果显示,DPV TK具有疱疹病毒的典型特征,含有ATP结合结构域和核苷酸结合结构域2个功能结构域,且具有与功能相关的磷酸化位点和氨酰化位点;编码的多肽链中亲水区域大于疏水区域,是一种膜外蛋白。DPV TK基因与禽类疱疹病毒(α-疱疹病毒)的进化关系最近。
- 葛菡徐超程安春汪铭书贾仁勇朱德康罗启慧陈孝跃
- 关键词：鸭瘟病毒胸苷激酶基因分子特性
- 鸭肿头出血症病毒强毒的致病性及感染组织细胞的超微病理变化被引量：2
- 2007年
- 将鸭肿头出血症病毒（DSHDV）强毒株以不同途径接种10日龄鸭胚，研究了病毒在鸭胚中的繁殖规律，并用透射电镜观察了感染鸭胚各组织器官的超微结构变化，同时用DSHDV人工感染不同日龄雏鸭，比较了不同感染途径对雏鸭的致病性和对不同日龄雏鸭的致病性。结果显示，尿囊腔和卵黄囊2种途径均能使病毒在鸭胚上繁殖并传代，对鸭胚的半数致死量分别为10^-7.24／0．2mL和10^-6.4／0．2mL。病毒感染鸭胚后，电镜下可观察到肝和尿囊膜中的病毒粒子，病毒粒子呈球形或椭圆形，大小为60～80nm，无囊膜；病毒在细胞浆内复制，可形成特征性包涵体；病毒侵害的主要靶器官为尿囊膜与肝，细胞器的变化主要表现为粗面内质网扩张以及线粒体肿胀和嵴断裂、消失。病毒经肌肉注射、口服和滴鼻均能使28日龄鸭感染发病，致死率分别为86％、89％和97％。研究表明，DSHDV能很好地在鸭胚上生长并致鸭胚各组织器官超微结构发生变化，不同感染途径均能使雏鸭感染发病且致病性强。
- 张舍郁朱德康程安春汪铭书沈婵娟李传峰张娜
- 关键词：鸭胚雏鸭
- 规模化鸭场鸭源致病性沙门氏菌的药物敏感性检测及耐药性分析被引量：17
- 2008年
- 钟传德程安春汪铭书李玲段泽于小娜仲崇岳陈孝跃
- 关键词：致病性沙门氏菌耐药性分析药物敏感性鸭源规模化猪霍乱沙门氏菌
- 鸭瘟病毒dUTPase基因克隆、原核表达及在病毒感染宿主亚细胞中的定位分析被引量：4
- 2008年
- 根据笔者实验室新发现的鸭瘟病毒(DPV)dUTPase基因(GenBank登录号DQ486149)序列设计1对引物,PCR扩增后将产物亚克隆至pET32a(+)原核表达载体,获得表达质粒pET32a-DU。然后将其转化至E.coliBL21(DE3)进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测显示诱导表达蛋白约66.8 ku,与预期表达蛋白大小一致。薄层扫描分析表明重组蛋白占菌体总蛋白的36.2%,主要以包涵体的形式存在。重组蛋白纯化后制备兔抗血清,间接ELISA效价为1∶409 600。通过免疫荧光技术进行DPV dUTPase亚细胞定位检测,结果显示最早可在感染后4 h的胞质中检测到特异性荧光,12 h大量点状绿色荧光聚集于胞核;24 h后胞核内点状荧光减弱,而胞质点状荧光增强;48 h胞核和胞质荧光均显著减弱。本研究为DPV dUTPase基因功能和DPV致病机理的研究提供了重要数据。
- 招丽婵程安春汪铭书袁桂萍贾仁勇周登春葛菡孙涛陈孝跃
- 关键词：鸭瘟病毒克隆亚细胞定位
- 原位杂交在病原微生物检测中的应用被引量：1
- 2010年
- 原位杂交技术是分子遗传学与细胞遗传学相结合而产生的一门新兴技术,具有很高的敏感性和特异性,在当今细胞生物学、分子生物学研究中有着广泛的应用。文章对原位杂交的产生和发展、基本方法和特点及其在病原微生物检测方面的研究进展进行了阐述。
- 娄昆鹏程安春汪铭书
- 关键词：原位杂交病原微生物
- 间接免疫荧光检测石蜡切片中鸭肿头出血症病毒及抗原定位方法的初步建立被引量：8
- 2008年
- 【目的】建立间接免疫荧光(IFA)检测石蜡切片中鸭肿头出血症病毒(DSHDV)的方法,为DSHDV感染的实验室诊断、DSHDV在感染鸭组织细胞中的亚细胞定位和动态研究提供有效的检测手段。【方法】用差速离心纯化DSHDV,将纯化DSHDV免疫家兔制备兔抗DSHDV高免血清,并以DEAE-SephadexA-50柱层析纯化出兔抗DSHDVIgG,建立IFA检测石蜡切片中DSHDV的方法;利用建立的IFA对28日龄鸭人工感染DSHDV死亡鸭不同组织器官以及临床样品进行检测。应用PAGE电泳分析DSHDV基因组特性。【结果】IFA最佳条件为:切片在0.01mol·L-1柠檬酸(pH6.0)缓冲液微波修复20min后,以10%马血清37℃下封闭30min,然后加入1﹕50的一抗4℃孵育过夜,最后加入1﹕100FITC标记的含0.01%伊文斯蓝的二抗37℃孵育30min。IFA检测DSHDV感染死亡鸭肝脏石蜡切片为阳性,而检测鸭瘟、禽流感病毒(H5N1)、鸭病毒性肝炎、鸭疫里默氏杆菌感染死亡鸭肝脏石蜡切片为阴性。IFA检测28日龄人工感染DSHDV死亡鸭的不同组织器官,心、肝、脾、胰、肺、肾、法氏囊、食管、气管、胸肌、胸腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和直肠为阳性;哈德氏腺、脑、皮肤、腺胃为阴性。阳性组织中病毒抗原主要分布在细胞浆。经甲醛固定保持1～6年的临床死亡鸭的病毒分离阳性肝脏,IFA检测结果也呈阳性。DSHDV具有呼肠孤病毒特征,有10条分节段核酸,呈"334"分布。【结论】建立的检测石蜡组织切片中DSHDV抗原的IFA具有直观、特异性强的优点,应用于DSHDV在感染鸭组织细胞中的亚细胞定位具有良好效果,可用于DSHDV感染的实验室诊断、病原在鸭组织细胞中分布研究。DSHDV抗原存在感染细胞浆,肠道、肾脏、法氏囊和胸腺是DSHDV侵害的主要靶器官。
- 张舍郁程安春汪铭书沈婵娟李传峰
- 关键词：间接免疫荧光抗原定位
- 间接免疫酶组织化学法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒感染和抗原定位被引量：6
- 2008年
- 以蔗糖密度梯度离心法提纯的猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)病毒SC1株作为抗原,免疫家兔制备兔抗PRRS病毒IgG,成功建立了检测PRRS病毒抗原的间接免疫酶组织化学法。该方法只与PRRS病毒感染猪组织呈现阳性反应,与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪乙脑病毒人工感染并致死仔猪的肝脏组织呈现阴性反应。用该方法检测PRRS SC-1株人工感染28日龄仔猪,在感染后7 d即可在肺门淋巴结、胸腺、扁桃体、十二指肠、肺、大脑和肾脏检测到PRRS病毒抗原。PRRS病毒抗原主要分布于胸腺和十二指肠感染细胞的胞浆内、肺门淋巴结小梁周围的淋巴窦和弥散的淋巴组织、扁桃体淋巴结的隐窝及其周边。该法具有特异、直观和敏感的特点,可用于PRRS病毒感染的实验室诊断、抗原定位及甲醛固定样本的回顾性诊断。
- 张平英朱德康程安春汪铭书刘伍梅李雪梅陈希文刘菲周毅陈孝跃
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原定位
