国际科技合作与交流专项项目(GJHZ20130408174112021)
- 作品数：18 被引量：56H指数：6
- 相关作者：刘志刚杨平常刘晓宇肖小军何韶衡更多>>
- 相关机构：深圳大学辽宁医学院附属第一医院南昌大学更多>>
- 发文基金：国际科技合作与交流专项项目国家自然科学基金深圳市科技计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生轻工技术与工程更多>>
- 田菁花粉过敏原的分离、纯化及鉴定被引量：2
- 2014年
- 目的初步分离、纯化及鉴定田菁花粉变应原蛋白。方法对田菁花粉粗提液进行提取,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对粗提液蛋白组分进行分离,并对其分子质量进行测定。收集10例过敏患者血清,通过免疫印迹法(Western-blotting)对花粉变应原成分进行鉴定,用离子交换层析对其变应原进行初步纯化,并通过免疫印迹法进行鉴定。结果田菁花粉有蛋白条带20余条,其中主要条带有12条,16、19和27ku为其特异性的过敏原,其中16和19ku为其主要过敏原。田菁花粉通过离子交换层析纯化出变应原主要集中在Ⅳ和Ⅰ峰,其对应的分子质量为16和19ku。结论初步分离、纯化及鉴定了田菁花粉变应原,为临床过敏性疾病的诊断和治疗奠定了基础。
- 刘玲肖小军李兵何韶衡杨平常刘志刚
- 关键词：变应原离子交换层析
- 牛奶过敏原β-乳球蛋白的单克隆抗体制备及其双抗体夹心法的建立被引量：6
- 2015年
- 目的制备与鉴定牛奶主要过敏原β-乳球蛋白(β-LG)的单克隆抗体,并建立双抗体夹心检测法。方法以β-LG为抗原免疫BALB/c小鼠,融合免疫鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤NS-1。半固体培养基法结合有限稀释法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,采用蛋白A亲和层析法获得纯化抗体。利用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型。间接ELISA方法和Western Blot鉴定抗体效价和特异性以及与其他过敏原的交叉反应性。建立双单克隆抗体夹心法,检测β-LG。结果共获得抗β-LG细胞株6株,分别命名为1H8,4A7,4C3,1F9,1G5,3D11,效价均高于20万。经抗体亚型鉴定,6株抗体均为Ig G1型。Western Blot的结果表明6株抗体能识别β-LG。在特异性检测实验中,6株抗体与其他种类食物过敏原无交叉反应,而1G5和3D11与牛奶酪蛋白过敏原有交叉反应性。通过建立双单克隆抗体夹心ELISA法,发现牛奶β-LG蛋白的检出低限为:15.625 ng/m L,标准曲线在15.625~250 ng/m L范围内线性良好。结论获得高效价抗体6株,建立了高效、高特异性的牛奶过敏原β-LG的检测方法,为食品中牛奶过敏原的检测提供了依据。
- 陈献雄邬玉兰吉琼梅杨平常刘志刚
- 关键词：单克隆抗体过敏原检测
- 粉尘螨过敏原Der f15的表达、纯化和生物信息学分析被引量：1
- 2015年
- 目的表达纯化出粉尘螨过敏原Der f15蛋白,并预测其三维结构及B细胞抗原表位。方法利用实验室已有的Der f15质粒转化到大肠杆菌Rosetta,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,通过亲和层析纯化蛋白,经免疫印迹法（Western-blot）分析Der f15免疫原性,用生物信息学方法分析Der f15的三维结构及B细胞抗原表位。结果高效表达出Der f15蛋白。SDS-PAGE结果显示：表达的产物分子量约107ku。经亲和层析成功纯化蛋白,纯化蛋白以尘螨过敏患者血清为一抗进行Western-blot,结果显示：Der f15重组蛋白能与患者血清IgE发生特异性结合,而阴性对照没有反应条带出现,表明Der f15具有良好的抗原性。对B细胞抗原表位的预测表明,Der f15蛋白的第20-35、121-131、340-359及485-500是潜在B细胞抗原表位。结论粉尘螨Der f15表达、纯化和生物信息学分析研究有助于了解Der f15蛋白的分子生物学特性,为粉尘螨过敏反应性疾病的特异性诊断和疫苗治疗奠定理论基础。
- 胡维詹政科刘玉琳喻海琼杨小猛刘晓宇
- 关键词：粉尘螨免疫印迹法
- 三裂叶豚草花粉致敏蛋白组分的分离、纯化及鉴定被引量：7
- 2014年
- 目的分离、纯化及鉴定三裂叶豚草花粉致敏蛋白组分。方法提取三裂叶豚草花粉粗提液,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离粗提液蛋白组分并测定其分子量。收集存在变态反应患者血清,通过免疫印迹法(Western-blotting)对花粉致敏蛋白组分进行鉴定,用离子交换层析初步纯化其致敏蛋白组分,并通过Western-blotting鉴定。结果三裂叶豚草花粉有30余条蛋白条带,其中有14条主要条带,其特异性致敏蛋白组分的相对分子质量为63 000、56 000、40 000和36 500,主要为63 000、40 000和36 500。三裂叶豚草花粉通过离子交换层析纯化出相对分子质量分别为63 000、40 000和36 500的致敏蛋白组分主要集中在Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ峰。结论初步分离、纯化及鉴定了三裂叶豚草花粉致敏蛋白组分。
- 刘玲肖小军李兵何韶衡刘志刚杨平常
- 关键词：离子交换层析
- 复方中药抑制大鼠肥大细胞脱颗粒的作用及其机制
- 2015年
- 目的探讨复方中药(Formula-3)抑制大鼠肥大细胞脱颗粒的作用及其机制。方法通过DNP-BSA-IgE激发建立致敏的RBL-2H3细胞模型。采用MTT实验检测Formula-3(中药组成:人参9g,干姜9g,黄连9g,当归9g,乌梅30g,灵芝30g)对细胞活性的影响;利用酶联免疫吸附法研究Formula-3对致敏肥大细胞β-氨基己糖苷酶及细胞因子的影响;共聚焦激光扫描荧光显微镜观察检测SOC通道的变化。结果成功建立致敏的细胞模型。Formula-3不会对细胞活性造成影响。Formula-3可减少致敏肥大细胞β-氨基己糖苷酶的释放,Th2型细胞因子和Th1型细胞因子的水平亦有显著变化(P<0.05);能够抑制肥大细胞膜上SOC通道的开放,Ca2+瞬变从1.83降至1.18(P<0.05)。结论 Formula-3通过抑制SOC通道的开放达到抑制肥大细胞脱颗粒的目的。
- 何伟逸杨成彬刘晓宇黄海珍杨平常刘志刚
- 关键词：复方中药肥大细胞脱颗粒
- DDC对婴儿双歧杆菌SOD酶活性的影响被引量：1
- 2016年
- 目的:探讨二乙基二硫代氨基甲酸酯(DDC)对婴儿双歧杆菌超氧化物歧化酶(SOD)活性的作用。方法:采用厌氧活化扩增法培养婴儿双歧杆菌,根据绘制出的最适生长曲线,在平台生长期内加入不同浓度(200、1 000μmol/L)的DDC作用一段时间(0、0.5、1、2、4、24 h),然后离心收集细菌、进行超声破碎,测定细菌裂解液中SOD的活性。作为阳性对照,我们也检测了DDC对小鼠肠道裂解液中SOD活性的影响。结果:我们发现上述不同浓度的DDC作用于婴儿双歧杆菌一定时间后,对其SOD活性无显著影响。动物实验表明DDC作用于小鼠一定时间后,与对照组相比,其SOD活性显著降低(P<0.01)。结论:DDC影响小鼠体内SOD活性,但不影响婴儿双歧杆菌SOD的活性。推断婴儿双歧杆菌SOD抑制剂不是DDC,SOD抑制剂尚需进一步研究。
- 罗燕葛兰陈红兵杨平常刘志刚杨波
- 关键词：抑制剂婴儿双歧杆菌超氧化物歧化酶
- 粉尘螨过敏原脂肪酶的表达、纯化及生物信息学分析被引量：2
- 2015年
- 为克隆原核表达并纯化出粉尘螨过敏原脂肪酶蛋白,鉴定其免疫学活性,并分析其分子特征.通过重组合成粉尘螨新过敏原脂肪酶基因,与p ET-28a载体连接后转化大肠埃希菌E.coli Top10,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组新过敏原脂肪酶蛋白;经镍柱亲和层析纯化出粉尘螨重组脂肪酶蛋白,用Western Blot、ELISA方法检测其免疫原性.用生物信息学软件预测其理化性质、二级结构,并构建分子进化树.成功表达纯化出高纯度的粉尘螨重组脂肪酶蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示表达重组产物分子质量约为40 k Da,与理论值一致,纯化后的表达产物经Western blot印迹检测有明显条带显示.信息学分析显示蛋白二级结构由α螺旋(16.38%)、延伸主链(18.93%)、无规则卷曲(64.69%)组成.成功原核表达出粉尘螨过敏原脂肪酶蛋白,并纯化获得较高纯度及较强免疫学活性的重组脂肪酶蛋白,为尘螨过敏性疾病的特异性诊断和免疫治疗奠定理论基础.
- 幸鹏刘玉琳喻海琼李盟刘志刚刘晓宇
- 关键词：粉尘螨生物信息学分析
- 粉尘螨13.8 kDa溶菌酶的克隆表达、纯化鉴定及生物信息学分析
- 2016年
- 目的克隆表达粉尘螨13.8kDa溶菌酶(Bac)基因,纯化鉴定蛋白的过敏原性,并进行生物信息学分析。方法挑取经纯培养的粉尘螨,提取总RNA,根据已知基因序列设计引物,经RT-PCR扩增Bac基因片段,产物连入pMD-32T载体中。扩增后,利用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切将目的基因片段连接到Pet-44a表达载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达;间接ELISA法检验重组Bac蛋白特异性过敏原性;clustalw2进行同源性分析,MEGA5工具包来构建系统进化树,ProtParam Tools预测其理化性质,PSIPRED预测其二级结构,SWISS-MODEL预测其三级结构。利用网络服务器IEDB内相关软件和Preprod,对Bac蛋白T细胞抗原表位进行预测。用DNAStar对Bac的B细胞抗原表位进行预测。结果经测序鉴定,本研究成功克隆出了粉尘螨Bac基因,其开放阅读框396bp,编码131组氨基酸。将Bac基因导入大肠杆菌E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导后高效表达Bac重组蛋白。该蛋白主要以可溶性形式存在,蛋白分子量约14kDa。间接ELISA法证明Bac能与粉尘螨过敏患者血清IgE结合。测序发现本实验室克隆的粉尘螨Bac基因与GenBank上公布的GenBank KF113885.1同源性为96%。系统进化树结果显示粉尘螨与屋尘螨亲缘关系比较近。理化性质预测显示Bac蛋白质较稳定。二级结构及三级结构预测结果显示Bac的结构主要以无规则卷曲组成。T细胞抗原表位预测得到4个肽序列(6-14、38-46、85-99、122-130)。B细胞抗原表位预测得到6个肽序列(15-30、26-40、44-59、58-73、95-110、101-116)。结论成功克隆并表达了粉尘螨Bac,并证实重组Bac蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究尘螨过敏原的结构成分及其理化性质奠定理论基础。
- 梁志林刘志刚邬玉兰陈思敏杨平常刘晓宇
- 关键词：粉尘螨生物信息学分析
- 花生主要过敏原Ara h1单克隆抗体的制备与应用被引量：7
- 2017年
- 目的制备与鉴定抗花生主要过敏原Ara h1单克隆抗体,建立双单抗ELISA法,检测食品中花生过敏原。方法以花生主要过敏原Ara h1为抗原免疫Balb/c小鼠,融合免疫鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞NS-1。半固体培养基法结合有限稀释法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后诱生小鼠腹水,采用蛋白A亲和层析法获得纯化抗体。利用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型。间接ELISA法和Western blot鉴定抗体效价和特异性以及与其他过敏源的交叉反应性。建立双单抗夹心ELISA法检测食品中的花生过敏原。结果共获得抗Ara h1细胞株4株,分别命名为2G9、5G4、5B5、2C7,效价均高于1∶106。经抗体亚型鉴定,4株抗体均为Ig G1型。Western blot的结果表明4株抗体均能识别Ara h1,其中2G9与5G4结合能力较强。在特异性检测实验中,2G9和5G4与其他种类过敏原无交叉反应。通过建立双单克隆抗体夹心ELISA法,发现花生Ara h1蛋白的检出低限为:5 ng/ml,标准曲线在~80 ng/ml范围内线性良好。利用此法检测了10种食品,结果显示在5种含有花生成分的食品中均检测到了花生过敏原。结论获得高效价抗体4株,建立了高效、高特异性的食品中花生过敏原的检测方法,为食品中花生过敏原的检测提供了依据。
- 陈献雄邬玉兰吉琼梅杨平常刘志刚
- 关键词：单克隆抗体过敏原检测
- 蚕蛹粗提浸液致敏小鼠哮喘模型的建立被引量：2
- 2014年
- 目的建立蚕蛹粗提浸液致敏Balb/c小鼠哮喘模型,检测分析蚕蛹粗蛋白致敏性。方法以Balb/c小鼠为模型实验动物,分为阴性组、阳性组。阴性组腹腔皮下注射生理盐水;阳性组腹腔注射蚕蛹粗提浸液致敏,连续3次,每次间隔1周。然后滴鼻激发1周每天1次。末次激发后24 h内进行气道高检测,收集支气管肺泡灌洗液(BALF)并对细胞进行分类、计数。检测特异性抗体(IgE)、细胞因子(IL-4、IL-10、INF-γ)以及肺组织病理变化等指标对模型的构建进行评价。结果阳性组的小鼠肺部病理改变明显,呈明显炎症病理改变,灌洗液中细胞计数明显升高,嗜酸性粒细胞明显升高(P<0.01),灌洗液IL-4、IL-10升高,INF-γ降低;阴性组各项指标均无升高。结论蚕蛹粗提浸液能使Balb/c小鼠发生致敏性哮喘,且致敏性强,建模成功,为以后相关过敏疾病防治奠定科研实验基础。
- 李维中詹政科杨成彬刘志强肖小军龚苗刘志刚
- 关键词：蚕蛹肺泡灌洗哮喘
