广东省科技厅科技计划项目(2003B30502)
- 作品数：9 被引量：52H指数：3
- 相关作者：何援利杨芳彭冬先刘木彪刘芸更多>>
- 相关机构：南方医科大学中国人民解放军第一军医大学中山大学更多>>
- 发文基金：广东省科技厅科技计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 重组人内皮抑素诱导人脐带静脉血管内皮细胞凋亡被引量：2
- 2006年
- 目的观察人内皮抑素重组蛋白对人脐带静脉血管内皮细胞增殖的影响。方法采用细胞凋亡的荧光检测法检测对内皮细胞凋亡的影响,MTT法观察不同浓度的重组人内皮抑素对人脐带静脉血管内皮细胞(ECV304)增殖的抑制作用。结果重组人内皮抑素具有明显的抑制内皮细胞增殖的作用,ED50=550ng/ml,随重组蛋白浓度的增加抑制作用更为明显。结论重组人内皮抑素对细胞增殖的抑制与其浓度呈正相关,存在剂量效应关系;内皮抑素抗血管生成的机制与其抑制内皮细胞增殖、诱导内皮细胞凋亡有关。
- 杨芳何援利
- 关键词：人内皮抑素内皮细胞细胞凋亡
- 人重组内皮抑素基因的克隆与融合表达
- 2005年
- 目的构建人内皮抑素(endostatin)融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中表达。方法用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)得到人内皮抑素全基因,连接PGEM-T载体,测序确认,定向克隆重组入pTRX表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果经SDS-PAGE分析,出现特异性蛋白质条带,大小与预期相符合。结论人内皮抑素基因在原核细胞表达载体pTRX中获得成功表达,为应用内皮抑素进行肿瘤的抗血管生成治疗奠定了基础。
- 杨芳杨秋芬何援利陈燕英
- 关键词：人内皮抑素
- 携带人内皮抑素基因的重组腺病毒构建及表达被引量：1
- 2008年
- 目的:内皮抑素是目前发现的作用最强的内皮细胞抑制因子,但内皮抑素蛋白极不稳定,难以制备及应用,故需要借助基因治疗发挥其抑制血管生成的作用。实验利用AdEasy-1系统构建并鉴定人内皮抑素重组腺病毒,并在人血脐静脉内皮细胞中表达出内皮抑素蛋白。方法:实验于2006-03/10在中山大学生命科学院完成。以Pshuttle-Endostatin质粒为模板,应用特异引物,通过聚合酶链反应扩增纯化得到Endostatin基因片断,经测序鉴定后,酶切插入穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与骨架质粒AdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,重组质粒经筛选、提取、纯化后,经酶切及测序鉴定正确,再大量扩增为腺病毒载体,线性化后利用脂质体2000转染AAV293细胞包装并扩增,得到的病毒液纯化扩增后,感染人脐静脉内皮细胞,反转录-聚合酶链反应检测感染细胞中目的基因的表达,蛋白免疫印迹检测感染细胞中蛋白的表达。结果:获得的Endostatin基因片段经酶切及测序鉴定正确,重组腺病毒质粒经酶切及测序鉴定正确,成功转染AAV293细胞,包装并扩增出病毒液,纯化后测滴度为2.06×1010pfu/mL,进一步感染人脐静脉内皮细胞,在其中检测到目的基因及蛋白表达。结论:人内皮抑素重组腺病毒pAd-Endo构建成功,且可在人脐静脉内皮细胞中表达出相应的目的基因及蛋白。
- 马颖何援利
- 关键词：抗血管生成基因治疗内皮抑素腺病毒人脐静脉内皮细胞
- 携带人分泌型内皮抑素基因重组腺病毒的制备和鉴定被引量：2
- 2006年
- 目的制备包含人分泌型内皮抑素基因的重组腺病毒,为下一步探讨其在血管生成依赖性疾病的治疗研究中的应用提供基础。方法以T-Endostatin质粒为模板,通过PCR扩增回收hEndostatin,将hEndostatin连接到pShuttle2中,构建pShuttle2-hEndostatin表达质粒,将此表达质粒连接到缺陷型腺病毒载体,构建Ad-hEndo。其线性化后转染HEK293T细胞,纯化后的重组腺病毒Ad-hEndo在HEK293T细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,并测定其滴度。结果利用PCR反应进行鉴定,扩增得到的hEndostatin经酶切鉴定,DNA测序证实为重组腺病毒,测定病毒滴度为5.2×109PFU/ml。结论本实验成功构建了人分泌型内皮抑素重组腺病毒Ad-hEndo,可直接用于血管生成依赖性疾病基因治疗的实验研究。
- 袁瑷芹何援利杨芳刘木彪
- 关键词：人内皮抑素腺病毒抗血管生成真核表达
- 人内皮抑素基因的克隆、表达、纯化及活性测定被引量：6
- 2005年
- 目的获得有生物学活性的人内皮抑素蛋白。方法用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)得到人内皮抑素编码区基因,连接PGEM-T载体,测序确认,定向克隆入pBV220表达载体,转化大肠杆菌DH5α进行表达、纯化及活性测定。结果经测序分析证实,所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素基因,构建表达载体在大肠杆菌中表达,经SDS-PAGE分析,出现特异性蛋白质条带,并具有生物学活性。结论人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达,表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖,为应用内皮抑素进行抗血管生成治疗奠定了基础。
- 杨芳何援利姜孝玉刘芸彭冬先宗利丽
- 关键词：人内皮抑素基因克隆纯化抗血管生成作用
- 子宫内膜异位症患者腹腔液血管内皮生长因子与内抑素的表达被引量：37
- 2004年
- 目的 探讨子宫内膜异位症(内异症)患者腹腔液中血管内皮生长因子(VEGF)和内抑素(ENS)在内异症血管生成调控机制中的作用。方法 采用ELISA法检测50例内异症患者(I～Ⅱ期26例、Ⅲ～Ⅳ期24例)和42例非内异症患者(对照组)腹腔液中VEGF和ENS的含量，分析二者浓度及其比值与内异症之间的关系。结果 内异症组腹腔液VEGF、ENS浓度和VEGF／ENS比值均高于对照组(P<0．01)；内异症患者中Ⅲ～Ⅳ期VEGF和ENS含量均高于I～Ⅱ期(P<0．01)，而VEGF／ENS比值前者则低于后者(P<0．01)。增殖期与分泌期比较，除内异症组VEGF水平前者高于后者外(P<0．05)，对照组VEGF和两组ENS水平两期比较均无差异(P>0．05)。结论 VEGF和ENS同时参与了内异症的血管生成调控，而两者表达水平的失衡可能才是内异症发病的关键。
- 刘木彪何援利彭冬先
- 关键词：子宫内膜异位症腹腔液血管内皮生长因子内抑素血管生成
- 人分泌型内皮抑素质粒的构建及序列测定被引量：4
- 2005年
- 目的 :旨在获得人内皮抑素 (endostatin)分泌型基因片段。 方法 :合成含信号肽的上游引物 ,用聚合酶链反应技术克隆人分泌型内皮抑素基因 ,10g/L琼脂糖凝胶电泳后回收 ,将其重组入PGEM T载体 ,双脱氧末端终止法测定其核苷酸序列。 结果 :经Genbank分析证实 ,所获得的 6 4 5bp基因片段序列属于信号肽及人内皮抑素功能区段基因 ,翻译为蛋白质序列正确。 结论 :本研究为应用内皮抑素基因进行肿瘤的抗血管生成治疗奠定了基础。
- 杨芳何援利姜孝玉刘芸彭冬先宗利丽
- 关键词：内皮抑素基因聚合酶链反应
- 内皮抑素与子宫内膜异位症相关研究进展
- 2006年
- 内皮抑素是目前已知最强的内源性血管生成抑制因子,它对以肿瘤血管为代表的活跃增殖的血管内皮细胞有强烈的选择性抑制作用,且无毒性、无耐药性,能明显对抗肿瘤的进行性生长。子宫内膜异位症的发生和进展与肿瘤类似,存在明显的新生血管依赖性,抑制异位血管增生被认为是治疗子宫内膜异位症的有效途径,从上提示,内皮抑素可能成为治疗子宫内膜异位症的有效药物。该文将结合内皮抑素的结构特点,围绕其抑制新生血管生成的作用机制,着重对其可能用于子宫内膜异位症诊断及治疗方面的相关研究进展作以综述。
- 袁瑷芹何援利彭冬先杨芳
- 关键词：子宫内膜异位症内皮抑素
- 携带内皮抑素基因的重组腺病毒的构建被引量：1
- 2007年
- 目的利用AdEasy-1系统,构建并鉴定人内皮抑素重组腺病毒,为后续的实验奠定基础。方法以PshuttleEndostatin质粒为模版PCR扩增内皮抑素基因片断,克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,在AAV293细胞中包装并扩增。结果重组腺病毒经测序、酶切鉴定正确,病毒滴度为2.06×1010pfu/ml。结论人内皮抑素重组腺病毒pAd-Endo构建成功。
- 马颖何援利杨芳
- 关键词：内皮抑素腺病毒基因治疗
