国家自然科学基金(81270587)
- 作品数：7 被引量：12H指数：2
- 相关作者：杨林花张耀方秦秀玉郭志萍陈剑芳更多>>
- 相关机构：山西医科大学第二医院山西医科大学山西大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金卫生部卫生公益性行业科研专项山西省卫生厅科技攻关计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 重型血友病A患者凝血因子Ⅷ基因14号外显子突变检测及分析被引量：1
- 2013年
- 血友病A（HA）是一种以凝血因子Ⅷ（FⅧ）缺乏为特征的X染色体连锁隐性遗传性出血性疾病。依据患者血浆FVII活性（FⅧ：C）水平，HA分为重型（FⅧ：C〈1％）、中间型（FⅧ：C1％～5％）和轻型（FVII7C5％～40％）。FVII基因1号内含子倒位、22号内含子倒位、14号外显子基因突变是目前最常见的基因缺陷类型。
- 张傲利杨林花刘秀娥张耀方齐喜玲
- 关键词：血友病A外显子突变检测重型遗传性出血性疾病X染色体连锁
- 一个遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症家系的基因诊断和生物信息学分析被引量：2
- 2015年
- 遗传性凝血因子Ⅶ（FⅦ）缺乏症是由FⅦ基因突变引起的一种罕见的常染色体隐性遗传性出血性疾病,发病率约1∶500 000.临床表现多样,轻者无明显症状,重者可发生颅内或者内脏出血.实验室检查可见凝血酶原时间（PT）延长,部分活化凝血活酶时间（APTT）及凝血酶时间（TT）正常,FⅦ活性（FⅦ∶C）降低.目前FⅦ基因突变数据库包括了279种导致遗传性FⅦ缺乏症的突变.我们联合使用直接测序法及生物信息学方法对一个遗传性FⅦ缺乏症家系进行基因分析,并探讨其发病机制.
- 郭志萍郭建利武瑞红张耀方秦秀玉刘秀娥杨林花
- 关键词：基因诊断家系部分活化凝血活酶时间学分
- 凝血因子Ⅷ野生型pIRES2-ZsGreen1真核表达载体的构建及鉴定
- 2016年
- 目的本研究以含有凝血因子Ⅷ(FⅧ)cDNA的pCI/FⅧ质粒为模板构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1/FⅧ并进行鉴定,在HEK-293细胞中表达。方法以pCI/FⅧ质粒为模板,扩增出FⅧ的开放阅读框(ORF)区,使用Infusion酶对线性pIRES2-ZsGreen1双酶切产物及FⅧORF扩增产物进行连接,连接产物进行转化后筛选阳性克隆,对阳性克隆进行DNA测序及凝胶电泳鉴定。野生型pIRES2-ZsGreen1/FⅧ转染HEK-293细胞后,采用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测野生型FⅧ基因mRNA表达水平。结果成功构建pIRES2-ZsGreen1/FⅧ并转染入HEK-293细胞中,实时定量PCR检测FⅧmRNA在HEK-293细胞中的表达,激光共聚焦显微镜观察转染情况。结论为实时观察FⅧ真核表达载体在HEK-293细胞中的表达及FⅧ基因突变导致血友病A的分子发病机制的研究奠定实验基础。
- 陈剑芳杨林花张耀方王梅芳康建民秦秀玉王刚
- 关键词：血友病A真核表达载体分子发病机制
- 重型血友病A患者凝血因子Ⅷ基因内含子22倒位检测被引量：8
- 2013年
- 目的检测重型血友病A（HA）患者凝血因子Ⅷ（FⅧ）基因内含子22倒位（INV22）的发生频率，探讨部分重型HA患者的发病机制，并对患者家系女性成员进行携带者诊断。方法126例重型HA患者均为男性，中位年龄14岁（4个月～63岁）。应用一期法检测凝血因子Ⅷ活性（FⅧ：C）；采用长距离PCR（LD—PCR）结合脉冲场凝胶电泳（PFGE）进行FⅧ基因1NV22检测，并对其中3例1NV22阳性患者进行家系调查。结果126例重型HA患者中检mINV22阳性患者52例（41．3％）。3个INV22阳性家系中疑为携带者的11例女性成员中检m携带者4例，其中3例为患者母亲，1例为患者胞姐。其中1个家系无家族史，该家系8名女性成员中除患者的姨表妹未检测外，其余7名成员检测结果显示患者母亲为INV22携带者，其外祖母及2个姨母、2个同胞姐妹及1个姨表姐均为非携带者。结论LD—PCR结合PFGE检测FⅧ基因INV22可用于部分重型HA患者和携带者基因诊断。
- 郭志萍陈剑芳秦秀玉张耀方杨林花
- 关键词：血友病A内含子聚合酶链反应
- 血友病A FⅧ基因内含子22重组基因型及检测方法被引量：2
- 2014年
- FⅧ基因内含子22重复序列发生染色体内相反方向的同源重组引起内含子22倒位,导致约45%-50%的重型血友病A;而同一染色体内、同源染色体间或染色单体之间的相同方向内含子22重复序列(intron 22homologous region,int22h)的重组导致两序列中间区域的复制或缺失,可以引起内含子22倒位的检测出现假阳性或假阴性。改良的长距离PCR及反向转变PCR(inverse shifting PCR,IS-PCR)可用于区分上述所有可能的int22h重组基因型。
- 郭志萍杨林花
- 关键词：血友病A基因重组
- 凝血因子Ⅸ野生型pIRES2-ZsGreen1真核表达载体的构建及其在HEK-293细胞的表达
- 2016年
- 目的以含有凝血因子Ⅸ（FⅨ）cDNA的pcDNA／FⅨ质粒为模板构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1／FⅨ并检测其在HEK-293细胞中的表达。方法以pcDNA／FⅨ质粒为模板，扩增出目的基因FⅨ的开放阅读框（ORF）区，使用Infusion酶对线性pIRES2-ZsGreen1双酶切产物及FⅨORF扩增产物进行连接，连接产物进行转化后筛选阳性克隆，对阳性克隆进行DNA测序及凝胶电泳鉴定。野生型pIRES2-ZsGreen1／FⅨ转染HEK-293细胞后，分别采用实时定量PCR、细胞免疫荧光法、一期法检测野生型FⅨ基因mRNA表达水平、蛋白的表达量及细胞裂解液、细胞培养液的FⅨ活性。结果成功构建pIRES2-ZsGreen1／FⅨ并转染HEK-293细胞，实时定量PCR证实HEK-293细胞表达FⅨmRNA，激光共聚焦显微镜下观察到FⅨ蛋白在细胞质中合成，野生型质粒pIRES2-ZsGreen1／FⅨ转染HEK-293细胞裂解液和细胞培养液的FⅨ活性分别为（92．03±0．29）％、（86．89±8．78）％，无转染的HEK-293细胞裂解液和培养液中FⅨ活性均为0。结论成功构建FⅨ野生型pIRES2-ZsGreen1真核表达载体。
- 陈剑芳张耀方康建民秦秀玉王梅芳王刚杨林花
- 关键词：血友病B真核细胞质粒
- microRNA125对无义突变的人凝血因子Ⅸ基因调控的分子机制被引量：1
- 2016年
- 目的构建人凝血因子Ⅸ小基因（Mini．hF9）及无义突变体，检测其mRNA表达水平，分析microRNA125对无义突变的F9基因表达调控的分子机制。方法利用PCR定点突变技术构建若干无义突变的人Mini—hF9并转染哺乳动物细胞HEK293T等，同时转染miR－125模拟物，通过实时荧光定量PCR（q—PCR）检测Mini—hF9基因mRNA表达水平。结果成功构建了Mini—hF9并在细胞中正确剪接。成功构建了无义突变体M1（nt34G〉TinExon7）、M2（nt52G〉TinExon7）和M3（nt85G〉TinExon7）。M1和M2突变体中Mini．hF9基因mRNA表达水平分别为野生型的14．1％（t=-15．464，P=0．004）和22．4％（t=-15．755，P=0．004），通过放线菌酮处理实验证实这是由于无义介导的mRNA降解（nonsense—mediatedmRNAdecay,NMD）所致。分别转染miR-125a模拟物和miR-125b模拟物后，M1突变体中Mini-hF9基因mRNA水平分别升高到1．70倍（t=-4．883，P=-0．039）和2．40倍（t=-17．537，P=0．003），M2突变体Mini—hF9mRNA水平分别升高到2．02倍（t=-19．264，P=0．003）和2．07倍（t=-9．158，P=0．012）。结论无义突变发生的位置是触发NMD途径的一个关键因素；microRNA125能够通过抑制NMD途径提高无义突变的凝血因子Ⅸ的mRNA水平。
- 王刚杨林花柴宝峰张翠明王梅芳王琨陈玙李玲
- 关键词：因子IX微RNAS基因表达调控
