教育部科学技术研究重大项目(01003)
- 作品数：11 被引量：73H指数：7
- 相关作者：郑杰由江峰王洁良崔湘琳宁钧宇更多>>
- 相关机构：北京大学青岛大学医学院附属医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金教育部科学技术研究重大项目国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白基因的筛选及其对转移性前列腺癌细胞生物学行为的影响被引量：2
- 2010年
- 目的筛选肿瘤转移相关新基因，探讨鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白基因（PAG1）转染对人前列腺癌细胞系PC-3M的高转移亚系PC-3M-1E8体外生物学行为的影响。方法利用PC-3M高转移亚系PC-3M-1E8、低转移亚系PC-3M-284，人肺巨细胞癌细胞系（PG）高转移亚系PG—BE1和低转移亚系PG—LH7cDNA制作4张基因芯片，筛选出PC-3M和PG高、低转移亚系共同差异表达基因。对在两个转移亚系共同表达下调的PAG1基因做进一步研究，采用即时定量PCR及Westernblot验证PAG1在PC-3M细胞系中的表达。构建pcDNA3．0-PAG1真核表达载体，稳定转染PC-3M-1E8细胞。MTT比色实验及软琼脂集落形成实验检测肿瘤细胞体外增殖能力；流式细胞术检测肿瘤细胞周期及凋亡；Matrigel穿膜实验检测肿瘤细胞体外侵袭能力。结果基因芯片初步筛选出PC-3M高、低转移亚系差异表达基因共327个，上调基因123个，下调基因204个。PG高、低转移亚系差异表达基因共281个，上调基因167个，下调基因114个。PC-3M与PG高转移亚系共同表达下调基因9个、上调基因8个。即时定量PCR及Westernblot证实PAG1在PC-3M高转移亚系中表达低于低转移亚系。MTT比色及软琼脂集落形成实验显示转染pcDNA3．0-PAG1组细胞增殖速度明显低于转染空载体组和未转染组（均P〈0．05）。细胞周期检测转染pcDNA3．0-PAG1组比转染空载体组和未转染组处于G0～G，期的细胞百分数明显增加（P〈0．05）。转染pcDNA3．0-PAG1组与转染空载体组和未转染组相比凋亡细胞百分率无显著差异（P〉0．05）。体外穿膜侵袭实验结果表明转染pcDNA3．0-PAG1组比转染空载体组和未转染组穿膜细胞数目明显减少，分别为（35．1±4．9）、（127．6±6．6）和（135．0±5．0）个（P〈0．05）。结论利用同一母系来源的高、低转移亚系制作基因芯片可以摒除转移无关基因的干扰，筛选出差异表
- 于文娟王曰伟谢志刚由江峰王洁良崔湘琳裴斐郑杰
- 关键词：肿瘤标记生物学寡核苷酸序列分析
- 肿瘤转移抑制基因1抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭能力被引量：12
- 2008年
- 目的研究肿瘤转移抑制基因1（TMSG-1）转染对高转移人前列腺癌细胞体外增殖能力和侵袭能力的影响。方法将TMSG-1全长真核表达载体稳定转染人前列腺癌细胞高转移亚系PC-3M-1E8，G418筛选，逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和Western blot方法选取TMSG-1过表达阳性克隆。通过活细胞计数、二苯基溴化四氮唑蓝（MTT）比色实验、软琼脂集落形成实验检测体外细胞生长能力；Matrigel穿膜实验检测肿瘤细胞体外侵袭能力。结果在稳定转染TMSG-1基因的PC-3M-1E8细胞系中，筛选出3株TMSG-1转录活性及蛋白表达水平均明显升高的细胞用于后续生物学行为实验。活细胞计数和MTT比色实验结果显示，从计数第3天起，与空载体对照组和空白对照组相比，3株正义转染组细胞生长速度均明显减慢（P〈0．05）。软琼脂集落形成实验结果显示，3株正义转染组的细胞软琼脂集落形成数与空载体对照组、空白对照组相比，均明显减少（P〈0．05），分别为26．00±3．21、13．33±1．45和32．83±2．18。Matrigel穿膜实验结果显示，正义转染的各组细胞与空载体对照组及空白对照组相比，穿膜细胞数均明显减少（P〈0．05），分别为45．33±4．16、54．00±2．83和26．33±3．79。结论TMSG-1表达上调可使高转移人前列腺癌细胞体外增殖速度、锚着不依赖性生长能力及侵袭能力明显降低，TMSG-1可能通过抑制肿瘤细胞生长和侵袭抑制肿瘤转移潜能。
- 苏静由江峰王洁良崔湘琳方伟岗郑杰
- 关键词：前列腺肿瘤肿瘤转移增殖基因转染
- TMSG-1基因转染对肿瘤转移表型的影响被引量：10
- 2003年
- 目的 :研究肿瘤转移抑制基因TMSG 1对肿瘤转移表型的影响。方法 :将含TMSG 1全长开放阅读框架的 1.5kbcDNA克隆于 pcDNA3,构建正义及反义TMSG 1cDNA真核表达载体 ,以脂质体转染人肺巨细胞癌PG的高转移亚系BE1,挑选G4 18抗性克隆 ,RT PCR检测正义或反义TMSG 1cDNA在转染细胞中的表达 ,进行转染细胞体外肿瘤生物学行为检测。结果 :RT PCR显示正义TMSG 1cDNA转染的BE1细胞 (BE1 S)中TMSG 1表达明显高于BE1及空载体对照细胞 ,反义TMSG 1cDNA转染细胞 (BE1 AS)中TMSG 1表达低于空载体对照细胞。与BE1及空载体对照细胞 (BE1 V)相比 ,BE1 AS细胞体外生长较快 ,软琼脂克隆形成能力明显增强 ;而BE1 S细胞体外生长能力没有显著改变 ,但其穿越Matrigel的能力及软琼脂克隆形成能力明显减弱。流式细胞仪分析结果显示BE1 S的G0 、G1期的细胞较BE1 V细胞比例增多 ,并且BE1 S出现了细胞凋亡峰。结论 :实验结果表明反义TMSG 1基因转染可增强BE1细胞的体外生长、体外侵袭能力及克隆形成能力。而正义TMSG 1基因转染则使BE1细胞的侵袭能力及软琼脂克隆形成能力减弱 ,而对细胞体外生长能力无明显影响。结论支持TMSG
- 边巴马春树由江峰宁钧宇方伟岗郑杰
- 关键词：肿瘤转移表型病理生理学
- 肿瘤转移相关基因TMSG-1编码蛋白的定位被引量：9
- 2002年
- 目的 明确肿瘤转移相关基因TMSG 1编码蛋白在细胞内的定位。方法 计算机分析TMSG 1的跨膜区 ,构建GFP与TMSG 1融合蛋白表达载体pEGFP C1 TMSG 1,以LipofectAMINE介导转染人前列腺癌细胞PC 3M 1E8,荧光显微镜与共聚焦显微镜下观察。结果 计算机分析表明所示 ,TMSG 1有四个跨膜区 (aa33～ 4 8,aa6 4～ 79,aa114～ 130 ,aa15 8～ 174 ) ,推测其为跨膜蛋白。PSORTⅡ软件分析TMSG 1蛋白定位于胞浆 (可靠性 94 .1% ) ,具体位置为内质网 6 6 .7%、线粒体 11.1%、质膜 11.1%、高尔基体 11.1%。显微镜下观察TMSG 1 GFP融合蛋白表达于胞浆 ,呈不均匀的颗粒状、环状分布 ;而对照的GFP蛋白则在胞核和胞浆呈弥漫性分布。结论 TMSG 1蛋白定位于细胞内膜系统 ;利用GFP进行的亚细胞定位具有精确、快速、可重复等优点 ,是研究基因与蛋白定位的有效方法。
- 马春树由江峰郑杰王洁良崔湘琳吴秉铨
- 关键词：肿瘤转移绿色荧光蛋白
- 应用RNA干扰技术研究激素非依赖性高转移潜能前列腺癌细胞中survivin的表达及意义被引量：3
- 2006年
- 目的研究 survivin 在激素非依赖性高转移潜能前列腺癌中的表达及其与前列腺癌的生物学行为及侵袭和转移潜能的相关性。方法应用 RNA 干扰技术构建 survivin 真核表达载体,转染人激素非依赖性前列腺癌高转移亚系 PC-3M-1E8细胞系。通过细胞生长曲线、肿瘤细胞裸鼠异种接种、软琼脂集落形成实验检测体内、体外细胞生长能力;流式细胞术检测 survivin RNA 干扰质粒对细胞周期及细胞凋亡的影响,Western blot 检测 caspase3活性片段,观察 survivin 抑制细胞凋亡的情况;Matrigel 穿膜实验检测肿瘤细胞体外侵袭能力。结果稳定转染 survivin RNA 干扰质粒的 PC-3M-1E8细胞中 survivin 的 mRNA 及蛋白水平明显降低,蛋白水平与阴性对照组相比,约下降78%～80%,差异有统计学意义(P<0.01);体外培养细胞生长速度及裸鼠体内肿瘤生长速度均明显减慢,锚着不依赖性生长的能力(软琼脂克隆形成数:14.33±3.51)与阴性对照组(52.33±6.81)及空白对照组(54.00±6.00)相比明显降低(P<0.01);凋亡细胞比例明显增加,空白对照组、阴性对照组及干扰阳性组的凋亡比例分别为5.88±0.99、6.97±1.60、16.40±1.95,干扰阳性组的凋亡比例显著高于对照组(P<0.01),并伴有 caspase3活性片段的表达增加;细胞阻滞在 G_0/G_1期(干扰阳性组、阴性对照组及空白对照组的细胞 G_0/G_1期的比例分别为52.71±1.10、43.59±1.83及43.65±3.44,P<0.05),并在细胞形态学上出现多核巨细胞现象;细胞体外侵袭能力明显降低,干扰阳性组的细胞(38.67±6.59)与阴性对照组(46.07±9.97)及空白对照组(47.87±9.58)相比穿膜细胞数明显减少(P<0.05)。结论 survivin 在激素非依赖性高转移潜能前列腺癌中高表达,并与细胞凋亡、细胞生长及肿瘤侵袭有关。抑制 survivin 的表达可能成为临床治疗激素非依赖性前列腺癌的方法之一。
- 朱翔宁钧宇由江峰王洁良崔湘琳方伟岗郑杰
- 关键词：前列腺肿瘤肿瘤侵润
- G3BP单克隆抗体制备及G3BP在肿瘤组织中表达的检测被引量：18
- 2005年
- 目的 为了研究G3BP(Ras- GAPSH3- bindingprotein)的功能及作用机制,采用原核表达G3BP蛋白诱导免疫,制备抗G3BP单克隆抗体,并检测G3BP在临床常见肿瘤中的表达情况。方法 采用原核表达载体pGEX- 5X1,通过IPTG诱导,使用大肠杆菌BL21,高质量表达GST -G3BP融合蛋白。将纯化后的原核表达蛋白注射BALB/c小鼠诱导产生免疫应答,采用经典杂交瘤技术制备单克隆抗体,并应用酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白免疫印迹和免疫组织化学染色ABC法进行抗体鉴定和肿瘤检测。结果 筛选出分泌抗G3BP抗体的单克隆杂交瘤细胞,免疫球蛋白亚类鉴定为IgG1,蛋白免疫印迹及抗原竞争抑制实验表明该抗体是特异性抗G3BP抗体。石蜡切片免疫组织化学法检测临床标本,在肺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌等临床肿瘤活检标本中检出G3BP表达明显增高。在乳腺癌临床组织标本中,G3BP表达水平与c -erbB2表达正相关,与淋巴结转移正相关。结论 成功制备了抗人G3BP单克隆抗体,所得到的特异性G3BP单克隆抗体能够应用于ELISA、Western蛋白免疫印迹以及免疫组织化学染色对不同样本的G3BP表达水平进行检测。G3BP在肺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤中表达明显增高。G3BP有可能作为肿瘤标志物辅助对乳腺癌预后的判断。
- 宁钧宇由江峰裴斐王洁良崔湘霖郑杰
- 关键词：G3BP单克隆抗体G3BP肿瘤组织基因表达免疫应答
- TMSG-1基因功能的初步研究被引量：2
- 2003年
- TMSG-1是用mRNA差异显示技术克隆的转移相关基因,它在高转移肿瘤细胞系和有转移的肿瘤组织中表达下降。以高转移的前列腺癌细胞系PC-3M-1E8为受体细胞,通过基因转染技术观察了TMSG-1基因表达对细胞V-ATPase活性、细胞内pH值和细胞凋亡情况的影响,同时利用GFP对TMSG-1细胞内定位进行了分析。结果表明,V-ATPase在PC-3M-1E8细胞系,转染空载体和转染反义TMSG-1细胞系的活性无明显差异。在转染正义TMSG-1的细胞系中,V-ATPase的活性比PC-3M-1E8细胞系,转染空载体和转染反义TMSG-1细胞系均有明显增高(P
- 马春树宁钧宇由江峰柳林郑杰方伟刚王洁良崔湘琳吴秉铨
- 关键词：前列腺癌MRNA差异显示基因转染基因表达PH值
- 鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白基因影响高转移人前列腺癌细胞体外生物学行为的机制探讨被引量：1
- 2010年
- 目的 探讨鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白（PAG1）基因对高转移人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8细胞体外生物学行为影响的机制.方法 异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导JM109细菌中GST-Raf1-Ras结合域（GST-Raf1-RBD）融合蛋白的表达,其中Raft-RBD能特异性的与活性Ras（GTP-Ras）结合,聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色观察融合蛋白诱导表达结果.GST-pull down实验检测稳定转染PAG1基因、转染空载体及未转染的PC-3M-1E8细胞中活性Ras水平.Western blot检测Ras信号通路相关蛋白表达变化.用异硫氰酸四甲基罗丹明（TRITC）耦联的鬼笔环肽标记F-肌动蛋白,激光扫描共聚焦显微镜观察肿瘤细胞形态和细胞内F-肌动蛋白排列变化.收集人前列腺及前列腺腺癌组织标本,通过免疫组织化学PV9000法检测PAG1蛋白的表达.结果 GST-Raft-RBD融合蛋白诱导表达结果显示,经IPTG诱导后在相对分子质量约33 000处出现较亮的GST-Raf1-RBD融合蛋白条带.GST-pull down结果显示PC-3M-1E8细胞稳定转染PAG1基因后,活性Ras蛋白表达明显减少,总Ras蛋白表达无明显变化.Western blot检测结果显示PC-3M-1E8细胞稳定转染PAG1基因后,磷酸化胞外信号调节激酶（ERK）表达明显减少,总ERK表达无明显变化;细胞周期素D1（cyclin D1）表达明显减少;p21WAF1/CIP1蛋白及磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）表达无明显变化.TRITC耦联的鬼笔环肽标记F-肌动蛋白结果显示稳定转染PAG1基因的PC-3M-1E8细胞F-肌动蛋白骨架结构紊乱,丝网状结构不明显,细胞呈长梭形,细胞表面伪足明显较少.免疫组织化学检测结果显示正常前列腺组织PAG1蛋白表达阳性率较高,前列腺腺癌组织中随着Gleason分级的增加,PAG1蛋白表达阳性率降低.结论 PC-3M-1E8细胞中PAG1表达上调能降低Ras活性,抑制ERK活化,进一步抑制cyclin D1的表达而引起细胞周期阻滞,抑制细胞增殖.PAG1表达上调可引起PC-3M-1E8细胞运动�
- 于文娟王曰伟由江峰王洁良崔湘琳裴斐郑杰
- 人肿瘤转移抑制基因TMSG-1单克隆抗体的制备、鉴定及在肿瘤检测中的应用被引量：22
- 2005年
- 目的 明确人肿瘤转移抑制基因TMSG- 1蛋白分子量大小和细胞定位,制备和鉴定TMSG- 1单克隆抗体,并探讨其在临床肿瘤标本检测的价值。方法 采用多肽固相合成法 (Fmoc法 )合成 15肽TMSG -1抗原片段,并与匙孔槭血蓝蛋白 (mcKLH)偶联,免疫BALB/C小鼠,采用细胞融合、ELISA法检测和快速有限稀释法筛选和制备单克隆抗体,并应用Western印迹和免疫组织化学ABC法染色进行抗体鉴定和肿瘤检测。结果 筛选出抗TMSG- 1抗体的单克隆杂交瘤细胞系C8,免疫球蛋白亚类测定为IgM。半抗原竞争抑制实验证实该抗体是特异的抗TMSG- 1抗体。Western印迹显示不转移癌细胞亚系 2B4和LH7有明显的相对分子质量为 45 .000蛋白条带,而高转移亚系 1E8和BE1则条带很弱。细胞免疫组织化学染色显示 2B4和LH7强阳性,为细胞膜和细胞质着色;而 1E8和BE1则为阴性。石蜡切片ABC法检测 52例乳腺癌和 41例结肠癌组织中TMSG- 1蛋白表达发现:未转移的癌组织多为中度阳性或强阳性,中度以上阳性率分别为 36% (乳腺癌 )和 52. 4% (结肠癌 );而转移的癌组织多为弱阳性或阴性, 中度以上阳性率分别为 7 .4% (乳腺癌 )和 35% (结肠癌 ),统计学分析表明TMSG 1在未转移癌组织中的表达显著高于转移性癌组织 (P<0 .05)。结论 成功制备了抗人肿瘤转移抑制基?
- 裴斐由江峰宁钧宇杨京平王玉萍韩志惠王洁良崔湘霖杨邵敏郑杰
- 关键词：乳腺肿瘤结肠肿瘤肿瘤转移单克隆抗体
- 胸腺素β10在人类乳腺癌中的表达被引量：8
- 2004年
- 目的:探讨胸腺素β10(Thymosinβ10,Tβ10)在人类乳腺癌中的表达及其临床病理意义。方法:采用兔抗人Tβ10多克隆抗体,ABC免疫组织化学方法检测经福尔马林固定、石蜡包埋的10例乳腺增生症、76例原发性乳腺癌及27例淋巴结转移性乳腺癌中Tβ10的表达状况,同时检测两种恶性度、转移潜能以及雌激素受体表达状况均不相同的乳腺癌细胞系中Tβ10蛋白的表达水平;此外,我们还检测了76例原发性乳腺癌临床病例中ER和c-erbB-2的蛋白水平。结果:Tβ10表达定位于胞浆中,10例乳腺增生症组织表达为阴性或仅在肌上皮内有非常微弱的表达。临床乳腺癌病例的阳性率为100%(76/76),但表达强弱有差别:伴早期浸润的原位癌弱于普通浸润癌,二者具有显著性差异(P<0.01);高分化组染色弱于中低分化组(P<0.05);虽然淋巴结转移灶内的染色强于原发癌,但此差异不具有统计学意义。伴/不伴淋巴结转移的组间差异无统计学意义(P>0.05)。在乳腺癌细胞系中,雌激素依赖性、恶性度和转移潜能较低的MCF-7细胞的Tβ10表达弱于雌激素不依赖性、恶性度和转移潜能较高的MDA-MB-231细胞。未发现Tβ10与ER和c-erbB-2的表达具有相关性。结论:虽然乳腺正常的肌上皮细胞中可存在少量Tβ10蛋白,但此蛋白在乳腺组织发生癌变和浸润的过程中会逐渐增高。
- 刘从容杨京平王玉平廖松林郑杰
- 关键词：乳腺癌免疫组织化学预后
