国家自然科学基金(30771922)
- 作品数：7 被引量：14H指数：3
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- 相关机构：重庆医科大学重庆医科大学附属第一医院第二军医大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 结核分枝杆菌Zmp1基因原核表达载体的构建及表达鉴定被引量：4
- 2014年
- 目的构建结核分枝杆菌锌离子依赖的金属蛋白酶1(Zmp1)基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法以卡介苗(BCG)基因组DNA为模板,采用PCR法扩增Zmp1基因;定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-Zmp1;转化入大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot法鉴定。结果PCR法扩增出Zmp1基因;重组表达质粒经双酶切及基因测序鉴定构建正确;表达的重组Zmp1融合蛋白相对分子质量(Mr)约为94 000,大小与预期融合蛋白一致;重组Zmp1融合蛋白可与His标签单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了Zmp1基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组Zmp1融合蛋白表达。
- 张继明杨春何永林穆柳青张春燕樊宇徐蕾
- 关键词：结核分枝杆菌原核表达
- 耻垢分枝杆菌与卡介苗作为载体在鼠结核病治疗中的作用比较被引量：3
- 2008年
- 目的比较耻垢分枝杆菌(MS)与卡介苗(BCG)作为载体在鼠结核病治疗中的作用。方法分别以不同剂量的MS和BCG免疫BALB/c小鼠,观察二者的致病作用。以结核分枝杆菌H37Rv感染BALB/c小鼠4周后,分别用生理盐水、MS、GLS/IL-12、重组MS、BCG及GLS/IL-12重组BCG治疗6次,于第6次治疗后7d处死小鼠,检测肺、脾荷菌量、血清IL-12和IFN-γ水平、脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的水平及肺、脾组织中颗粒溶素表达,并观察小鼠肺组织病理改变。结果重组MS和重组BCG组器官荷菌量明显低于MS和BCG组;重组MS和重组BCG组血清IL-12和IFN-γ水平明显高于MS和BCG组,MS和BCG组明显高于生理盐水组;重组MS和重组BCG组脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的水平明显高于其他组;MS与BCG组比较,重组MS与重组BCG比较,荷菌量、病理变化、肺、脾中的IL-12和IFN-γ水平差异均无显著意义;淋巴细胞中的IFN-γ和TNF-α水平,MS与BCG组差异有显著意义,而重组MS与重组BCG组差异无显著意义;重组MS和重组BCG组在肺、脾中均有颗粒溶素表达;MS所致病变比相同剂量BCG轻。结论MS与BCG一样,可将要表达的基因靶向递送到相应的组织,并诱导特异性细胞免疫,同时其在体内的副作用低于BCG,因此可作为良好的有机载体。
- 杨春张黎何永林徐蕾李娜王渝伟朱道银
- 关键词：耻垢分枝杆菌卡介苗颗粒溶素结核病
- Ipr1和GFP基因真核共表达穿梭质粒的构建及其在人肺癌细胞中的表达
- 2009年
- 目的构建胞内病原体抗性基因1(Ipr1)和绿色荧光蛋白(GFP)基因真核共表达穿梭质粒,并在人肺腺癌细胞A549中表达。方法采用PCR方法,分别从质粒pEGFP-C1-Ipr1和pEGFP-C1中扩增Ipr1和GFP基因,将GFP基因、分枝杆菌复制子OriM和Ipr1基因同时克隆入多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,构建pBud-GFP-OriM-Ipr1穿梭质粒,脂质体法转染A549细胞,荧光显微镜观察GFP的表达,免疫组化方法检测Ipr1蛋白的表达。结果酶切和测序分析表明,pBud-GFP-OriM-Ipr1真核共表达穿梭质粒构建正确。转染A549细胞后,荧光显微镜下可观察到转染细胞中有GFP表达,免疫组化法可检测到Ipr1蛋白的表达,且定位于细胞核内。结论已成功构建Ipr1和GFP基因真核共表达穿梭质粒,为进一步研究Ipr1抗结核的功能奠定了基础。
- 王瑜伟朱道银张黎李娜杨春
- 关键词：绿色荧光蛋白穿梭质粒共表达肺癌细胞
- 滴鼻途径建立鼠结核病模型的探讨被引量：3
- 2010年
- 目的探讨滴鼻途径建立BALB/C小鼠结核分枝杆菌感染的模型的可行性。方法人型MtbH37Rv标准株经腹腔接种小鼠,取小鼠腹腔冲洗液100μl接种改良罗-琴氏培养基。刮取上述培养基上生长4周已恢复毒力的结核分枝杆菌H37Rv标准株,加0.05%Tween80生理盐水磨菌制成悬液,菌落计数,计数后稀释悬液为5×103CFU/50μl、5×104CFU/50μl、5×105CFU/50μl及50μl生理盐水分别感染4组Balb/c小鼠,制作结核分枝杆菌感染模型。结果滴鼻感染小鼠4周后,所有小鼠肺、脾组织中均可见抗酸阳性菌,在感染小鼠肺、脾组织匀浆均培养出Mtb。肺组织病理改变明显,正常肺泡结构消失,以充血实变、淋巴细胞、巨噬细胞浸润为主,增生性改变不明显,未见明显的组织坏死。脾组织病理改变主要是巨噬细胞和淋巴细胞增生。结论滴鼻感染途径建立小鼠结核病模型简便、可行,为进一步研究开发重组BCG疫苗对鼠结核病的防治打下良好的基础。
- 杨春何永林徐蕾张黎伊正君李娜王渝伟
- 关键词：结核病动物模型
- 结核分枝杆菌PPE68基因真核表达质粒的构建及鉴定被引量：3
- 2011年
- 目的:构建结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis,Mtb)PPE68基因的真核表达质粒,观察PPE68基因在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达。方法:将MtbPPE68基因克隆亚至真核表达质粒pBudCE4.1中,构建真核表达质粒pBudCE4.1-PPE68。以真核表达质粒pBudCE4.1-PPE68体外转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,通过RT-PCR及Western blot法分别在转录水平及翻译水平检测PPE68基因的表达。结果:重组表达质粒经双酶切所切下的片段大小与理论值相符,测序结果与Gen-bank注录的PPE68基因序列一致。重组质粒瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7,用RT-PCR及Western blot法分别在转录水平及翻译水平检测PPE68基因的表达。结论:成功构建了PPE68基因的重组真核表达质粒pBudCE4.1-PPE68,并在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中得到了成功表达。为对其免疫原性、免疫反应性及免疫保护作用的进一步研究奠定了基础。
- 靳志栋何永林徐蕾佘茜张丹张壮苗杨春
- 关键词：MTBPPE68巨噬细胞
- 细胞内病原体抗性基因1的原核表达被引量：1
- 2012年
- 目的构建细胞内病原体抗性基因1(Intracellular pathogen resistance 1,Ipr1)的原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达。方法以pMD19-T simple-Ipr1质粒为模板,采用PCR法扩增Ipr1基因,克隆至表达载体pET-32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-Ipr1,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定构建正确;表达的重组Ipr1蛋白相对分子质量约为70 000,以1.5 mmol/L IPTG诱导4 h,目的蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的16%,重组Ipr1蛋白可与His标签单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了Ipr1基因重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了重组Ipr1蛋白,为进一步探讨Ipr1蛋白的功能及Ipr1重组BCG的构建奠定了基础。
- 佘茜徐蕾徐蕾何永林靳志栋张丹
- 关键词：结核病原核细胞基因表达
- 重组耻垢分枝杆菌与微卡在鼠结核病免疫治疗作用中的比较
- 2009年
- 目的比较颗粒溶素/白介素-12重组耻垢分枝杆菌(rMS)和微卡作为免疫治疗佐剂在鼠结核病治疗中的效果及机制。方法结核分枝杆菌H37Rv感染Balb/c小鼠4周后,分别用生理盐水、耻垢分枝杆菌(MS)、rMS、INH+PZA,rMS+INH+PZA、微卡+INH+PZA治疗6次,于第1次治疗后3个月处死小鼠,检测器官荷菌量、血清IL-12和IFN-γ分泌水平和肺、脾组织中颗粒溶素表达及观察小鼠肺、脾组织病理改变情况。结果rMS+INH+PZA器官荷菌量明显低于微卡+INH+PZA、rMS和INH+PZA药物组;血清IL-12水平rMS+INH+PZA和单纯rMS组明显高于微卡+INH+PZA和INH+PZA组;IFN-γ分泌水平rMS+INH+PZA、单纯rMS组和微卡+INH+PZA明显高于单纯的药物组;用免疫组化检测到单纯rMS组和rMS+INH+PZA组在肺脾组织中颗粒溶素的表达;rMS+INH+PZA、微卡+INH+PZA、单纯rMS组和INH+PZA组肺组织病变轻且局限,生理盐水组肺组织病理改变以渗出为主,病变广泛,正常肺泡结构被破坏。结论rMS和微卡对小鼠结核病有一定免疫治疗作用,rMS通过增强宿主Th1型免疫应答和GLS的抗菌活性有关,而微卡主要通过调节免疫应答发挥作用;rMS对临床常用的抗结核药协同作用优于微卡,为结核病的综合治疗打下实验基础。
- 杨春何永林徐蕾张黎伊正君李娜王渝伟朱道银
- 关键词：耻垢分枝杆菌微卡免疫治疗结核病
