国家高技术研究发展计划(2004AA213072)
- 作品数：29 被引量：86H指数：6
- 相关作者：张涌华松曹俊伟马利兵彭树英更多>>
- 相关机构：西北农林科技大学内蒙古农业大学内蒙古科技大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 猪传染性胃肠炎病毒S基因抗原位点片段的真核表达被引量：2
- 2007年
- 为探讨利用转基因动物乳腺生物反应器生产基因疫苗的可行性,构建了以奶牛β-酪蛋白启动子为调控序列,增强型绿色荧光蛋白为报告基因的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因抗原位点区乳腺表达载体pEGBS。通过脂质体介导方法将其转染小鼠乳腺癌细胞EMT6,在倒置荧光显微镜下可观察到明亮的绿色荧光分布于阳性细胞,并且RT-PCR检测结果显示,RT-PCR扩增产物与目的基因片段大小相符,证明其确实源于重组质粒转录后的mRNA。
- 吕宁彭树英张涌
- 关键词：猪传染性胃肠炎病毒S基因
- 人端粒酶基因(hTERT)对牛耳成纤维细胞凋亡的影响
- 2007年
- 为了提高体细胞核移植的效率,试验探讨了转染外源性hTERT基因对核移植供体细胞———牛耳成纤维细胞的影响。试验应用脂质体介导hTERT基因转染,用相差显微镜观察转染前后的细胞状态,用RT-PCR、W estern blot法检测hTERT基因是否整合并表达,用流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化和凋亡的情况,并进行核型分析。结果表明:转染48 h后能看到明显的荧光,经600μg/mLG418筛选后,获得阳性克隆,转染后的细胞形态上基本无变化,hTERT基因整合并表达;经流式细胞仪检测,转染前后生长周期无明显变化,凋亡率极显著降低(P<0.01),核型正常;转染hTERT基因后的牛耳成纤维细胞的凋亡率显著低于未转染的细胞,并且形态正常,表明转染hTERT后,使体外培养的牛耳成纤维细胞生命力得到延长,为核移植提供了数量更多的高质量的核供体细胞。
- 隋丽娜彭新荣王亚刚张涌
- 关键词：HTERT基因转染细胞凋亡
- 人溶菌酶/乳铁蛋白双基因重组质粒在牛乳腺细胞中的表达
- 2010年
- 研究检测人溶菌酶/乳铁蛋白双基因重组质粒pEBH-IL在牛乳腺上皮细胞中的表达。采用脂质体转染技术,将pEBH-IL质粒DNA导入体外培养的牛乳腺上皮细胞中。加入G418对转染的细胞加压筛选,获得稳定转染的细胞。采用绿色荧光蛋白（EGFP）和PCR方法检测牛乳腺细胞基因组中的目的基因,并采用Westhorn Blot对重组质粒在牛乳腺细胞表达产物进行检测。试验表明：G418筛选获得稳定转染的细胞,对照组加压后第7 d细胞全部死亡,转染组第12~15 d汇片达80%左右;在荧光显微镜下观察到EGFP表达;PCR检测到目的基因;阳性细胞培养液中检测到目的蛋白的表达。结果表明：以人溶菌酶/乳铁蛋白为目的基因构建的重组质粒pEBH-IL在牛乳腺细胞中具有表达功能。
- 曹俊伟马利兵何晓宁舒建洪张涌
- 关键词：人溶菌酶人乳铁蛋白牛乳腺上皮细胞
- 牛-牛及山羊-牛克隆胚胎体外培养条件的优化被引量：3
- 2007年
- 通过胞质内注射法将牛和山羊胎儿耳朵成纤维细胞分别注入去核牛卵母细胞中构建同种胚胎和异种胚胎。采用mCR2aa和mSOF分别培养,然后在mSOF中按不同培养时间添加8mg/mLBSA或者10%FBS,培养前3d和培养3d后添加的补充物质及次序为:(1)BSA+FBS;(2)BSA+BSA;(3)FBS+BSA;(4)FBS+FBS。根据培养胚胎的卵裂率、8/16-cell发育率、囊胚发育率及囊胚细胞数筛选出最好的培养方法。结果:(1)mSOF中培养同种胚胎和异种胚胎的卵裂率,8/16-cell发育率以及囊胚发育率均明显高于在mCR2aa中的培养结果(P<0.05)。(2)添加BSA+FBS组的mSOF培养胚胎的卵裂率、8/16-cell发育率、囊胚发育率和囊胚细胞数同种依次为79.8%±7.1%、49.7%±3.5%、21.5%±1.8%和115.2±4.3,异种依次为40.1%±6.3%、29.2%±2.0%、13.4%±2.1%和100.1±3.0,均明显高于其他培养组(P<0.05)。结论:山羊-牛异种克隆胚胎可以用优化的牛胚胎培养体系进行培养。同种胚胎和异种胚胎的最佳培养方法均为前3d用mSOF+BSA培养液,3d后用mSOF+FBS培养液。
- 张林华松张涌权富生刘风军廖列如蒋永海
- 关键词：山羊核移植胚胎
- β-巯基乙醇对牛孤雌胚胎发育的影响被引量：4
- 2008年
- 【目的】研究β-巯基乙醇（β-ME）对牛卵母细胞核成熟和孤雌胚胎发育的影响。【方法】向OMM和SOF中添加0，0．05，0．10和0．15mmol／L β-ME，并在牛卵母细胞激活后，分别于1-细胞期、8～16细胞期、桑葚胚期向SOF中添加0．1mmol／L β-ME，通过比较胚胎体外发育水平确定添加β-ME的最佳时期。【结果】β-ME对牛卵母细胞核成熟无显著影响（P〉0．05）；0．05和0．10mmol／L β-ME均可显著提高牛孤雌胚胎的卵裂率及囊胚发育水平，但以0．10mmol／Lβ-ME添加组的效果较佳；牛孤雌胚胎发育到1-细胞期和8～16细胞期前，添加0．10mmol／L的β-ME，均可显著提高囊胚的发育水平（P〈0．05），但1-细胞期添加β-ME时的囊胚率、囊胚细胞数显著高于8～16细胞期组（P〈0．05），故1-细胞期是添加β-ME的最佳时机。【结论】β-ME对牛卵母细胞核成熟无促进作用，但可提高牛孤雌胚胎的卵裂率并促使囊胚发育，且在8～16细胞期前添加β-ME均可提高囊胚发育水平，但以1-细胞添加0．10mmol／Lβ-ME的促进效果最佳。
- 舒建洪张志鹏李向臣华松曹俊伟张涌
- 关键词：孤雌激活卵母细胞胚胎培养
- TSA处理供体细胞对组蛋白乙酰化和核重编程效果的影响被引量：6
- 2009年
- 克隆胚胎基因组的不完全重编程是克隆动物成功率低的主要原因。试验中以第5代牛胎儿成纤维细胞作为供体核,以牛卵母细胞作为受体胞质进行体细胞核移植,用75 nmol.L-1曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)分别处理供体细胞6、12和24 h,通过核移植检测克隆胚胎发育率,并应用激光共聚焦显微镜技术和流式细胞术检测处理细胞和克隆囊胚组蛋白H3K18乙酰化水平和细胞周期。结果显示:随着TSA处理时间的延长,供体细胞组蛋白H3K18乙酰化水平不断提高;以75 nmol.L-1TSA处理供体细胞12 h的克隆胚的囊胚发育率显著高于未处理组(23.5%vs 15.7%,P<0.05);供体细胞经TSA处理的克隆囊胚组蛋白H3K18乙酰化水平与未处理组相比差异不显著(P>0.5);处理组和对照组细胞G0/G1期和S期比例间存在显著差异(P<0.05)。结论:TSA对核供体细胞的处理存在时间效应,75 nmol.L-1TSA处理12 h的牛胎儿成纤维细胞更易被卵母细胞重编程,显著提高了克隆胚的体外发育能力,初步证实TSA是通过提高供体细胞组蛋白乙酰化水平来促进供体细胞重编程的。
- 张东杨鹭王勇胜刘根胜刘利杰万敏张涌
- 关键词：核移植曲古抑菌素A重编程
- 供体细胞来源及预处理对牛体细胞核移植效率的影响
- 2007年
- 以牛外耳皮肤成纤维细胞为核供体细胞,比较了不同同步化诱导方式(血清饥饿法与接触抑制法)、供体细胞冷冻与否、供体动物性别与年龄等因素对体细胞核移植效率的影响。结果表明,接触抑制法处理的供体细胞核移植胚囊胚率显著高于饥饿法(P<0.05);未冷冻的供体细胞核移植胚囊胚率显著高于冷冻供体细胞(P<0.05);成年母牛供体的囊胚率显著高于成年公牛(P<0.05);不同年龄供体细胞的核移植胚囊胚率差异不显著(P>0.05)。试验表明,以接触抑制法诱导未冷冻成年母牛外耳皮肤成纤维细胞为核供体,有利于核移植胚囊胚的发育。
- 曹俊伟马利兵张弛毕聪明赛务加甫舒建洪华松张涌
- 关键词：供体细胞体细胞核移植胚胎发育
- EGF和不同血清对牛卵母细胞成熟及核移植胚体外发育的影响被引量：4
- 2007年
- 分离牛卵母细胞,分别用添加表皮生长因子(EGF)和发情牛血清(发情当天血清(OCS(0 d))和发情第7天血清(OCS(7 d)))的培养液进行成熟培养后去核,构建牛体细胞核移植胚并进行体外培养,研究EGF和OCS对卵母细胞成熟及核移植胚体外发育的影响。结果表明EGF添加组和OCS(0 d)添加组卵细胞的成熟率及核移植胚的卵裂率和囊胚率分别为74.5%,84.6%,25.9%和83.9%,78.8%,31.3%。在牛卵母细胞成熟液中添加EGF、OCS(0 d)更有利于牛核移植胚胎的发育。
- 王亚刚隋丽娜彭新荣赛务加甫郭志林李向臣王勇胜张涌
- 关键词：表皮生长因子胎牛血清
- 山羊胎儿成纤维细胞转染人t-PA指形区缺失基因及其核移植研究被引量：7
- 2007年
- 采用阳离子脂质体法将人t-PA指形区缺失基因乳腺特异性表达载体(pEBT)导入山羊胎儿成纤维细胞,以山羊胎儿成纤维细胞和转染的山羊胎儿成纤维细胞作供体,构建核移植胚,对其体外发育情况进行了研究,比较了2种供体细胞(山羊胎儿成纤维细胞和转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞)及转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞饥饿处理与否对核移植胚胎体外发育的影响。结果表明,早期核移植胚有荧光蛋白(GFP)的表达;以山羊胎儿成纤维细胞作供体细胞时,核移植胚的桑葚胚率(50.3%)及囊胚率(16.0%)均高于以转人t-PA指形区缺失基因胎儿成纤维细胞为供体时的桑葚胚率(48.4%)和囊胚率(10.9%),但差异不显著(P>0.05);转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞经饥饿处理后,其核移植胚胎的卵裂率(73.6%)与不饥饿时的卵裂率(73.9%)差异不显著;饥饿处理后核移植胚胎的桑葚胚率(48.5%)和囊胚率(11.2%)均高于不饥饿处理的桑葚胚率(39.2%)和囊胚率(9.2%),但差异不显著(P>0.05)。本研究成功地构建了转人t-PA指形区缺失基因的体细胞核移植胚胎,体外囊胚率为11.2%。
- 赵晓娥安志兴马保华武浩高立功刘新颖张涌
- 关键词：血清饥饿囊胚率
- 猪乳腺细胞分离培养及EGFP基因转化被引量：2
- 2009年
- 本研究旨在从猪乳腺组织中分离得到上皮细胞和成纤维细胞,并将EGFP基因导入这些细胞。利用乳腺细胞培养体系从成年猪乳腺组织中分离培养上皮细胞和成纤维细胞,并利用脂质体介导转染技术将EGFP基因导入这些细胞。结果,从成年猪乳腺组织中成功分离培养出上皮细胞和成纤维细胞,获得转EGFP基因上皮细胞和成纤维细胞。上皮细胞呈短梭形或多角形,细胞之间紧密相靠,互相衔接,连接成片;细胞核呈圆形或椭圆形,核仁2~4枚,比较明显。成纤维细胞呈长梭形。结果表明,可以从猪乳腺组织中分离上皮细胞和成纤维细胞,EGFP可以在这些细胞中表达。
- 郑月茂贺小英
- 关键词：乳腺上皮细胞EGFP基因
