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转染TFPI基因对人前列腺平滑肌细胞增殖的影响: 2009年; 目的良性前列腺增生（BPH）是严重危害老年男性健康的常见疾病，本研究旨在研究组织因子途径抑制因子（TFPI）基因对前列腺平滑肌细胞生长的影响，为良性前列腺增生的基因治疗提供参考依据。方法取前列腺增生患者手术切除的前列腺组织，采用酶消化法分离前列腺平滑肌细胞；免疫组化方法进行细胞鉴定；pIRES—TFPI基因转染前列腺平滑肌细胞，以pIRES基因作为基因转染阴性对照；用细胞计数法和四氮唑蓝MTT法观察细胞增殖情况；采用RT-PCR检测细胞内TFPI基因的表达情况。结果SMA免疫组化染色和MASSON染色显示：经过5次传代后，前列腺平滑肌细胞的纯度达到95％以上；TFPI基因转染后，前列腺平滑肌细胞内的TFPImRNA水平明显提高，是未转染组的7倍、阴性对照基因转染组的3．5倍；基因转染4d后，TFPI基因转染组的前列腺平滑肌细胞数明显低于阴性对照基因转染组。结论提示TFPI基因对前列腺平滑肌细胞的增殖具有调控作用，有必要对其作用机理进行进一步研究。; 朱敦皖宋丽萍董霞李昭夷刘兰霞张海玲冷希岗; 关键词：细胞增殖基因转染

人脐动脉平滑肌细胞培养及转染TFPI基因的实验研究被引量：1: 2010年; 目的探讨组织因子途径抑制因子（TFPI）基因对人脐动脉血管平滑肌细胞生长的影响,为TFPI基因用于血管再狭窄的治疗提供理论依据和实验基础.方法从人脐动脉分离平滑肌细胞,通过免疫组化方法进行细胞鉴定;用不同剂量pIRES-TFPI基因（分别为1,2,3 μg/mL）转染血管平滑肌细胞,采用RT-PCR测定细胞内TFPI表达以优化基因转染条件;通过MTT法测定TFPI基因对人脐动脉血管平滑肌细胞生长的影响.结果分离得到的血管平滑肌细胞的纯度高于90%;3个剂量的基因转染后,细胞内TFPI基因的表达水平无明显差异.采用2 μg/mL转染剂量时,TFPI基因转染后第5天,脐动脉血管平滑肌的生长受到明显抑制.结论通过基因转染的方式将TFPI基因导入细胞对人脐动脉平滑肌的增殖具有抑制作用.; 董霞朱敦皖宋丽萍刘兰霞张海玲冷希岗; 关键词：人脐动脉平滑肌细胞组织因子途径抑制因子血管再狭窄

人组织因子途径抑制因子在毕赤酵母中高拷贝表达: 2011年; 目的构建高拷贝表达重组人组织因子途径抑制因子的毕赤酵母并对蛋白表达条件进行初步优化，为相关研究奠定基础。方法将PCR扩增得到的TFPIcDNA片段与表达质粒pPIC9K连接构建重组质粒rhTFPI—pPIC9K，采用PCR方法及DNA测序对其进行鉴定。将重组质粒转化酵母细胞GSI15，利用G418抗性实验筛选含有高拷贝TFPIcDNA的毕赤酵母菌株，采用WesternBlot和TFPI检测试剂盒分析重组蛋白表达。通过改变诱导温度、诱导时间及甲醇浓度对重组蛋白表达条件进行初步优化。结果PCR扩增rhTFPI-pPIC9K得到预期的扩增条带（1．2kb），经酶切图谱分析及测序确认成功构建表达质粒rhTFPI—pPIC9K。实时定量PCR结果显示，通过G418筛选获得了含高拷贝基因的酵母细胞，WesternBlot结果显示含基因拷贝数与蛋白表达量呈正相关。通过对表达条件的优化，明显提高了TFPI重组蛋白的表达量，重组TFPI表达量高达（9．95±0．78）mg／L，活性达到（3．91±1．37）U／mL。结论成功构建了高效表达TFPI重组蛋白的毕赤酵母细胞株，为TFPI功能研究及在相关疾病防治中的应用提供了坚实的实验基础。; 程旭徐伟杰宋丽萍刘兰霞董霞张海玲朱敦皖冷希岗; 关键词：组织因子途径抑制因子毕赤酵母

组织因子途径抑制因子重组蛋白表达和纯化方法的优化被引量：1: 2009年; 目的:对组织因子途径抑制因子(TFPI)的表达条件和纯化方法进行优化,降低重组蛋白制备成本。方法:应用巴斯德毕赤酵母表达系统进行TFPI重组蛋白的表达,采用不同浓度甲醇进行重组蛋白表达诱导,观察不同pH对重组蛋白活性的影响,应用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析和凝胶过滤层析相结合的方法纯化重组蛋白。结果:重组蛋白的表达量达到1.5mg/L培养基。上述蛋白纯化方法所得回收率为43.1%,蛋白纯度大于95%,蛋白活性保持良好。结论:优化后的蛋白表达量比优化前得到明显提高,本研究采用的纯化方法操作简单、耗时短、成本低且回收率较高。; 韩彦峰刘兰霞宋丽萍董霞张海玲冷希岗; 关键词：凝血致活酶重组蛋白质类毕赤酵母甲醇氢离子浓度

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天津市科技攻关项目(06YFGPSH03700)