中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(ITBB110303) 作品数:16 被引量:47 H指数:4 相关作者: 刘志昕 张雨良 王健华 王洪星 余乃通 更多>> 相关机构: 中国热带农业科学院 海南大学 海南省农业科学院 更多>> 发文基金: 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项 国家现代农业产业技术体系建设项目 国家自然科学基金 更多>> 相关领域: 农业科学 生物学 医药卫生 更多>>
甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测体系研究 被引量:2 2013年 甘蔗黄叶综合症(yellow leaf syndrome,YLS后称甘蔗黄叶病)是由甘蔗黄叶病毒(sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)引起的一种重要的甘蔗病害,为更快、更准确地检测ScYLV,合成了一对特异性引物s-pf和s-pr,建立了运用SYBR Green I荧光染料法检测ScYLV的实时荧光RT-PCR体系,并对该体系的特异性、灵敏性和适用性进行了测试。结果表明:该检测体系能特异地检出ScYLV,对测试的高粱花叶病毒不能检出,灵敏度比常规PCR高100倍,适用性广。实时荧光RT-PCR检测整个过程完全闭管,无需PCR后处理且SYBR Green I荧光染料成本较低,适用于检测甘蔗体内含量较低的ScYLV病毒。 王洪星 龚殿 张雨良 王健华 刘志昕关键词:甘蔗黄叶病毒 感染BBTV香蕉叶片cDNA文库的构建及评价 2013年 为了研究香蕉束顶病毒与香蕉寄主致病的互作分子机制,本文报道利用Make Your Own"Mate&Plate" Library System试剂盒成功构建感染BBTV香蕉叶片的cDNA文库。通过改良CTAB法提取感染BBTV香蕉叶片的总RNA,采用SMART法反转录合成双链cDNA,经靳,酶切并去除短片段之后,与经同样酶切的pGADT7-SfiI载体连接,利用电转法将重组载体转化到大肠杆菌宿主细胞中,获得初级cDNA文库,最后以初级文库100万克隆为基数扩增,得到扩增文库并提取质粒。结果得到库容量大于2.0X10。的初级文库,检测表明文库cDNA插入片段长度主要分布在700—2000bp,文库重组率为87.5%。结果表明,该文库质量较好,可用于后续酵母双杂交互作蛋白筛选试验,本研究为开展病毒与寄主互作的研究奠定基础。 谭老喜 张雨良 周朋 章绍延 王健华 张秀春 刘志昕关键词:香蕉束顶病毒 香蕉叶片 应用多重RT-PCR检测甘蔗黄叶病毒和高粱花叶病毒 被引量:8 2011年 建立了多重RT-PCR同时检测甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)和高粱花叶病毒病毒(Sorghummosaic virus,SrMV)的技术体系,该体系可有效地对甘蔗田间植株和试管苗进行检测。根据引物之间的互补性及引物的Tm值筛选多重PCR引物。确定适宜的PCR缓冲液的浓度为1×,退火温度为53℃,延伸温度为72℃。 王洪星 张雨良 罗志文 杨文君 龚殿 孙玉娟 张树珍 刘志昕关键词:多重RT-PCR 病毒检测 甘蔗 香蕉束顶病毒Haikou2分离物DNA2编码框原核表达及抗血清制备 2012年 香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)是危害香蕉的主要病毒之一,严重威胁着香蕉的生产。BBTV基因组至少由6个环状ssDNA组分组成,其中DNA2组分变异最大,是否编码蛋白及其功能缺乏研究。本研究通过PCR方法克隆了BBTV Haikou2 DNA2 ORF,将其构建到pET32a载体中,进行原核表达和抗血清制备。结果表明重组表达载体pET32a-DNA2ORF在表达菌Transetta(DE3)中表达一个约21 ku的特异融合蛋白,通过超声波破碎仪破碎细胞和诱导条件优化,分析表明,该蛋白主要以可溶形式存在,最佳表达条件为30℃、1.0 mmol/L IPTG诱导3 h。融合蛋白经过Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化,免疫家兔制备出抗血清。Western blot实验表明抗血清具有特异性;酶联法(ID-ELISA)测定表明,抗血清效价达到25 000,能够检测出香蕉汁液中加入的0.954μg/mL浓度的表达纯化蛋白。 谭老喜 王洪星 张雨良 王健华 章绍延 周朋 余乃通 刘志昕关键词:原核表达 抗血清制备 高粱花叶病毒Hcpro、CP和PIPO基因酵母双杂交载体构建及自激活验证 2012年 采用同源克隆技术获得侵染甘蔗高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)的Hcpro、CP、PIPO基因片段。将该基因片段连接至pGBKT7载体,分别构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-Hcpro、pGBKT7-CP和pGBKT7-PIPO,经PCR、酶切及测序鉴定,证明重组诱饵载体构建成功后,将重组质粒导入Y2H Gold酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。结果表明,含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性。含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His营养缺陷平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对ADE2、HIS3报告基因无自激活作用。研究结果为下一步利用酵母双杂交系统检测与高粱花叶病毒Hcpro、CP、PIPO蛋白相互作用的甘蔗蛋白提供基础。 张雨良 黄启星 张树珍 王健华 余乃通 刘志昕关键词:CP 酵母双杂交 诱饵载体 海南地区番木瓜花叶病病原的分子鉴定与多样性分析 被引量:1 2014年 番木瓜环斑病毒(Papaya ring spot virus,PRSV)和番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf-distortion mosaic virus,PLDMV)是热带、亚热带地区严重威胁番木瓜农业生产的主要病害。本研究对27份疑似番木瓜花叶病病叶样品进行分子鉴定,提取病叶总RNA,反转录获得对应的cDNA,根据PRSV病毒的CP、P1、Hc-Pro和NIb基因序列和PLDMV病毒的CP基因序列设计特异性引物进行PCR检测和测序分析。研究发现PRSV感染20例(74.1%),PLDMV感染3例(11.1%),PRSV和PLDMV交叉感染的样品1例(3.7%)。多样性分析结果表明,海南地区PRSV病毒存在3个株系,株系之间出现明显分化;海南地区PLDMV病毒与日本和台湾地区报道的PLDMV病毒株系有共同的起源。研究结果表明PRSV和PLDMV是海南地区番木瓜花叶病的主要病原,其中PRSV病毒3个株系之间P1基因同源性在95%以下,这可为后续研究构建抗PRSV和PLDMV的双价表达载体提供数据支持。 张雨良 黄启星 朱丽娣 孔华 曾会才 姜浩元 刘志昕关键词:番木瓜 PRSV ScYLV和SrMV的PCR引物优化设计 被引量:4 2012年 以甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,,ScYLV)和高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,,SrMV)为材料,运用DNAMAN、Primer Premier 5.0和Oligo6.0等软件设计PCR引物,,进行普通PCR、多重PCR、实时定量PCR反应,检验所设计引物的PCR扩增效率、特异性和有效性。归纳总结多种PCR反应中引物设计的一般性思路,提出启发性的方法,并将以上经验付诸实践检验;最后将研究思路概括为:针对性、实用性和一般性。 王洪星 张雨良 罗志文 杨文君 刘志昕关键词:甘蔗黄叶病毒 PCR 引物设计 PRIMER 应用多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光定量PCR检测甘蔗黄叶病毒和高粱花叶病毒 被引量:4 2012年 基于已报道的甘蔗黄叶病毒(Sugarcane Yellow Leaf Virus,ScYLV)cp基因和高粱花叶病毒(Sorghummosaic virus,SrMV)NSP基因序列设计特异性引物,建立了针对这两种病毒的实时荧光定量PCR(real time-quantitative,RT-qPCR)检测方法。在此基础上,利用扩增产物Tm值的不同,建立了可区分ScYLV与SrMV的多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光定量PCR方法,两种病毒扩增产物的Tm值分别为80.8~82.8℃和84.6~86.6℃。检测数据显示:SrMV和ScYLV均有各自的特异性峰值出现,而健康植株无特异性峰值;在单独检测中的检出水平分别可达500和250 copy/μL;两种病毒Tm值的批内变异系数分别为0.03%和0.02%,批间变异系数分别为2.06%和3.12%。综上所述,所建立的多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光定量PCR方法在对以上两种病毒的检测中具有较好的特异性、敏感性和稳定性。 王洪星 张雨良 王健华 章绍延 熊国如 刘志昕关键词:甘蔗黄叶病毒 SYBR 病毒检测 高粱花叶病毒外壳蛋白的原核表达及其抗血清制备 被引量:3 2013年 高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)是世界上分布最广的侵染甘蔗的病毒之一,引起甘蔗花叶病,对甘蔗产业危害很大。根据SrMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列合成一对引物,以海南(SrMV-HN)染病植株总RNA为材料,采用RT-PCR方法克隆了长约987 bp的目的片段。将CP基因与质粒pET32a(+)连接,构建了含SrMV CP基因的融合蛋白原核表达载体pET32a-SrMVCP。然后用正确的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测出一条约36kD的特异融合蛋白表达谱带。融合蛋白主要以可溶性蛋白形式稳定表达。通过优化诱导条件,确立了CP基因表达的最佳条件:IPTG终浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为4 h,诱导温度为30℃。用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白,免疫家兔制备出抗血清。通过酶联法(ID-ELISA)测定本试验制备的SrMV CP抗血清工作浓度为1∶1 000,Western blotting检测结果表明,抗血清与SrMV-HN诱导表达的CP蛋白发生特异性反应。对田间25个甘蔗样品进行检测,结果表明该抗血清的效价高、灵敏度高、特异性强,可以应用于田间样品的检测。 王洪星 龚殿 孙玉娟 张雨良 王健华 刘志昕关键词:外壳蛋白 原核表达 抗血清 感染高粱花叶病毒甘蔗叶片cDNA文库构建及评价 被引量:7 2012年 为了研究甘蔗花叶病与甘蔗寄主致病的互作分子机制,利用SMART技术成功构建了感染高粱花叶病毒甘蔗叶片的cDNA文库,用于后续酵母双杂交互作蛋白筛选试验。采用Omega公司Plant RNA Kit提取感染高粱花叶病毒甘蔗叶片总RNA,经过Oligotex纯化获得mRNA,将其反转录成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR扩增双链cDNA。经SfiI酶切并去除短片段后,连接到pGADT7-SfiI载体上,成功获得初级cDNA文库,最后以初级文库100万克隆为基数扩增,得到扩增文库并提取质粒。经检测构建的文库容量为1.6×106cfu,文库滴度2.2×106cfu/mL,文库cDNA插入片段长度主要分布在700~2 000 bp,文库重组率约为96%。结果表明,该文库质量较好,为筛选分离抗病功能基因及开展寄主与病毒互作的研究奠定了基础。 张雨良 张树珍 王健华 熊国如 王俊刚 余乃通 刘志昕关键词:甘蔗