广州市医药卫生科技项目(2008-ZDi-14)
- 作品数：10 被引量：17H指数：3
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- 不同机械牵张应力对大鼠肺泡巨噬细胞HMGB1表达的影响被引量：9
- 2009年
- 目的评价不同机械牵张应力对大鼠肺泡巨噬细胞高迁移率族蛋白1（HMGB1）表达的影响。方法雄性SD大鼠，周龄8～12周，体重270～320g，放血处死后，收集支气管肺泡灌洗液，分离、培养和传代肺泡巨噬细胞。将细胞接种于6孔培养板中，细胞浓度10^5／ml，培养48h后，随机分为5组（11=6），对照组（C组）不施加机械牵张应力；S1-4组分别施加5％、10％、15％和20％机械牵张应力，牵张频率30次／min，牵张时间24h。采用RT-PCR法测定HMGB1 mRNA表达；采用Westemblot方法测定HMGB1表达。结果肺泡巨噬细胞给予机械牵张应力后，HMGB1及其mRNA表达随机械牵张应力的增大而上调（P〈0．05或0．01）。结论大鼠肺泡巨噬细胞HMGB1的表达与机械牵张应力呈强度依赖性。
- 丁宁肖慧许立新佘守章
- 关键词：HMGB1蛋白
- 利用生物素-链亲和素系统筛选呼吸机所致肺损伤HMGB1启动子结合蛋白
- 2009年
- 目的:筛选呼吸机所致肺损伤(VILI)高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的启动子结合蛋白.方法:制备VILI大鼠模型,与正常对照组大鼠同期处死,取肺组织提取细胞核蛋白.用PCR法扩增末端带生物素标记的HMGB1启动子探针,将细胞核蛋白与制备的HMGB1启动子探针进行孵育,再以标记有链亲和素的磁珠分离HMGB1启动子-蛋白反应复合物,分别用0.25mol/L和1mol/LNaCl洗脱探针上结合的蛋白,SDS-PAGE电泳分离样品蛋白,并对凝胶进行银染显色,比较VILI组与正常对照组的差异条带.结果:两组细胞核蛋白中共观察到24条差异条带.分析差异条带显示,与正常对照组比较,在低亲和力作用水平,机械通气后有6个蛋白与HMGB1启动子的结合力增强,有2个蛋白的结合力减弱;在高亲和力作用水平,有10个蛋白与HMGB1启动子的结合力增强,有6个蛋白的结合力减弱.结论:筛选到一些VILI特异性HMGB1启动子结合蛋白,对于研究HMGB1的转录调控机制具有重要意义.
- 丁宁肖慧许立新佘守章
- 关键词：高迁移率族蛋白B1急性肺损伤启动子
- 人高迁移率族蛋白B1原核表达及其高亲和噬菌体融合肽的筛选
- 2010年
- 目的 构建谷胱甘肽巯基转移酶（GST）标记的人高迁移率族蛋白B1（HMGB1）融合蛋白表达载体并在原核细胞中表达.应用噬菌体展示技术筛选HMGB1的高亲和肽.方法 用RT-PCR方法扩增HMGB1 cDNA,构建于原核表达载体pGEX4T-1并转化大肠杆菌,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导GST-HMGB1蛋白表达;Ni^2＋-NTA和多粘菌素B亲和层析柱进行纯化重组HMGB1蛋白.以重组HMGB1蛋白为靶分子,进行4轮噬菌体展示环七肽库的筛选,从第4轮洗脱物中随机挑选20个单克隆噬菌体扩增后进行ELISA鉴定,用酶标仪测定450 nm处的吸光度值.对获得的阳性单克隆噬菌体分别进行扩增、纯化,并对DNA测序,以确定插入七肽的氨基酸序列.结果 RT-PCR扩增HMGB1 cDNA大小约648 bp,成功构建了pGEX4T-1-HMGB1重组质粒并纯化了HMGB1蛋白,其相对分子质量为65000.经过4轮筛选后,噬菌体富集了74倍（第4轮与第1轮回收量分别为5.2×10^8、7.0×10^6 pfu）,随机挑取的20个噬菌体克隆中9个可与HMGB1结合,测序发现其中的6个序列一致,均为DYFVSSV.结论 筛选到1个可与HMGB1高亲和结合的噬菌体展示七肽,其对HMGB1活性的拮抗效应有待进一步阐明.
- 丁宁肖慧许立新佘守章
- 关键词：高迁移率族蛋白质类细菌噬菌体肽库谷胱甘肽转移酶
- 限制性输液对失血性休克大鼠血流动力学的影响被引量：2
- 2009年
- 目的探讨限制性输液对失血性休克大鼠血流动力学的影响。方法制作大鼠失血性休克模型,采取限制性输液和大量输液两种不同输液方法复苏大鼠失血性休克,对比各组不同时间点的血流动力学变化,记录出血量、输液量并计算生存率。结果休克模型120 min后,与大量输液组比较,限制性输液组的呼吸、心率降低,有统计学意义,平均动脉压和中心静脉压明显升高(P<0.05);休克急救期,限制性输液组失血量少于大量输液组(P<0.05),输液量明显低于大量输液组(P<0.05);休克后24 h和72 h生存率比较,限制性输液组高于大量输液组(P<0.05)。结论限制性输液能明显改善失血性休克大鼠的血流动力学,减少失血量以及输液量,提高生存率,是复苏失血性休克的理想方法。
- 肖慧丁宁刘灵芝佘守章
- 关键词：限制性输液血流动力学失血性休克
- 应用噬菌体展示技术筛选HMGB1启动子结合蛋白被引量：5
- 2010年
- 目的:筛选高迁移率族蛋白B1(HMGB1)启动子结合蛋白。方法:应用噬菌体展示技术,以HMGB1启动子DNA作为固相筛选分子,对噬菌体展示环七肽库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"生物筛选,从第4轮洗脱物中随机挑选20个单克隆噬菌体扩增后进行ELISA鉴定。对所筛选克隆进行DNA序列测定和生物信息学分析。结果:经过4轮筛选后,对随机选取的20个噬菌体克隆进行鉴定,其中11个可与HMGB1启动子结合。DNA测序后经过同源性搜索,确定了与HMGB1启动子具有结合作用的蛋白,包括激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)等6种已知功能蛋白和2种未知功能蛋白。结论:筛选到HMGB1启动子的结合蛋白,为研究HMGB1基因的转录调控机制奠定基础。
- 丁宁肖慧高巨许立新佘守章
- 关键词：高迁移率族蛋白1启动子噬菌体展示肽库基因表达调控
- 应用LiquiChip液相蛋白芯片技术检测HMGB1诱导肺泡巨噬细胞的细胞因子表达谱被引量：1
- 2010年
- 目的检测高迁移率族蛋白B1(HMGB1)诱导肺泡巨噬细胞(AM)的细胞因子表达谱。方法 RT-PCR扩增HMGB1 cDNA,插入pGEX4T-1原核表达载体并转大肠杆菌,IPTG诱导HMGB1表达,Ni2+-NTA和多粘菌素B亲和层析柱分离纯化。应用LiquiChip液相蛋白芯片检测HMGB1(20ng/ml)诱导AM细胞因子表达谱的变化。结果成功表达纯化的重组HMGB1可诱导AM肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、MIP-2、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及γ-干扰素(IFN)-γ的表达显著增加(P<0.01)。结论 HMGB1可诱导AM释放多种炎性细胞因子。
- 丁宁肖慧许立新佘守章
- 关键词：高迁移率族蛋白B1肺泡巨噬细胞细胞因子
- HMGB1启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在机械牵张诱导下的活性检测
- 2009年
- 目的构建高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)启动子的红色荧光蛋白报告基因载体。方法采用基因重组技术构建含HMGB1启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRed1-1-HMGB1P。经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将重组载体转染HEK293细胞,在荧光显微镜下观察其在细胞内的表达以及对机械牵张刺激的反应。以转染空载体pDsRed1-1的细胞作为对照。结果PCR、酶切和DNA测序表明重组载体pDsRed1-1-HMGB1P的构建正确,该表达载体在HEK293细胞静息状态下表达水平较低,经机械牵张刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光。转染空载体pDsRed1-1的细胞未见红色荧光。结论成功构建了HMGB1启动子的红色荧光蛋白报告基因载体,对机械牵张刺激有很好的反应。
- 丁宁肖慧高巨许立新佘守章
- 关键词：高迁移率族蛋白B1红色荧光蛋白机械牵张
- 盐酸戊乙奎醚预先给药对呼吸机所致肺损伤大鼠水通道蛋白5表达的影响被引量：1
- 2012年
- 目的探讨盐酸戊乙奎醚对呼吸机所致肺损伤大鼠肺组织水通道蛋白5(AQP5)表达的影响。方法32只SD大鼠随机分为4组(n=8):对照组(C组)、大潮气量通气所致肺损伤组(ALI组)、盐酸戊乙奎醚低剂量组(P1组)和高剂量组(P2组),P1和P2组分别于机械通气前30 min经股静脉注射盐酸戊乙奎醚0.3和1.0mg/kg,随后进行机械通气,通气参数设定同ALI组。模型成功后取动脉血样行血气分析;取肺组织,光镜观察肺病理变化,免疫组化检测AQP5的表达;检测肺组织湿/干重比(W/D比),考马斯亮蓝法测支气管肺泡灌洗液(BALF)蛋白含量,双缩脲法测血浆蛋白含量,并计算肺通透性指数(LPI)。结果与C组比较,ALI组、P1组和P2组pH值、PaO2和AQP5表达下降,PaCO2、肺W/D比及LPI升高(P<0.05);与ALI组比较,P1组和P2组pH值、PaO2和AQP5表达升高,PaCO2、肺W/D比及LPI下降(P<0.05);P1组和P2组各指标组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论盐酸戊乙奎醚0.3、1.0 mg/kg预先给药能够减轻大潮气量机械通气所致的大鼠肺损伤,其机制可能部分与通过上调AQP5的表达,减轻肺组织通透性和肺水肿有关。
- 于霖忽新刚丁宁许立新佘守章
- 关键词：呼吸机所致肺损伤盐酸戊乙奎醚水通道蛋白5
- 机械牵张诱导THP-1细胞高迁移率族蛋白B1移位出核被引量：1
- 2011年
- 目的:探讨机械牵张对高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在THP-1细胞内移位的影响。方法:构建HMGB1-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白的真核表达载体。通过两步亚克隆的方法,将HMGB1和EGFP的编码序列以融合蛋白的形式克隆到pcDNA3-HA载体上,随后转染THP-1细胞并施加机械牵张应变,荧光显微镜观察HMGB1在细胞内的表达及移位情况。结果:重组质粒经酶切鉴定证明构建正确,并在THP-1细胞中大量表达。荧光显微镜观察发现,HMGB1-EGFP融合蛋白主要分布于细胞核,经机械牵张18 h,可见细胞中融合蛋白从细胞核移位到细胞质,在细胞浆中观察到明显的绿色荧光。结论:成功构建了HMGB1-EGFP融合蛋白,在THP-1细胞中观察到机械牵张可诱导HMGB1移位出核。
- 丁宁肖慧许立新佘守章
- 关键词：机械牵张高迁移率族蛋白质类THP-1细胞
- p38MAPK在周期性机械牵张诱导肺泡巨噬细胞表达HMGB1中的作用被引量：5
- 2009年
- 目的:研究p38 MAPK在周期性机械牵张诱导肺泡巨噬细胞(AM)表达高迁移率族蛋白B1(HMGB1)中的作用。方法:大鼠AM随机分为A、B、C3组,A组为对照组;B组细胞施加20%牵张应变,牵张时间为4h;C组细胞的牵张模式与B组相同,在牵张前用p38 MAPK特异性抑制剂SB203580(40μmol/L)预处理2h。利用RT-PCR法检测HMGB1 mRNA的表达,Western blotting检测HMGB1蛋白表达和p38 MAPK的活性。结果:与对照组相比,AM施加20%牵张应变可诱导HMGB1蛋白和mRNA表达明显增加、p38 MAPK活性明显增高(均P<0.05),SB203580可显著抑制牵张应变的这种诱导作用(均P<0.05)。结论:周期性机械牵张可能通过p38 MAPK信号通路,调节肺泡巨噬细胞HMGB1 mRNA和蛋白的表达。
- 丁宁肖慧高巨许立新佘守章
- 关键词：机械牵张P38MAP激酶肺泡巨噬细胞
