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嵌合鞭毛蛋白fliC/esat的佐剂效应研究: 目的:为研究嵌合表达结核分枝杆菌(MTB)抗原ESAT-6的鞭毛蛋白的免疫佐剂效应。方法:PCR方法扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白基因fliCi及MTB抗原ESAT-6编码序列,通过overlap PCR将ESAT-6编码序列...; 张辉文科黄金林胡茂志申峻松潘志明焦新安; 关键词：ESAT-6 鞭毛蛋白佐剂 TH1应答; 文献传递

结核分枝杆菌CFP-10单克隆抗体的研制与初步鉴定被引量：5: 2009年; 目的:制备抗结核分枝杆菌CFP-10蛋白的单克隆抗体(mAb)。方法:应用淋巴细胞杂交瘤技术,以重组菌BL21(DE3)-pET-30a(+)-lhp原核表达的融合蛋白His-CFP-10作为抗原免疫BALB/c小鼠,以纯化的融合蛋白GST-CFP-10作为检测抗原,制备抗结核分枝杆菌CFP-10mAb;采用间接ELISA、Dot-ELISA和Western blot鉴定mAb的特异性。结果:获得2株稳定分泌抗结核分枝杆菌CFP-10mAb的杂交瘤细胞株6E8、2E7,其Ig亚类分别为IgG1、IgG2b。mAb6E8、2E7腹水的ELISA效价分别为1∶1000000,1∶1024000。在Dot-ELISA试验中,这2株mAb均只与表达His-CFP-10及GST-CFP-10的重组大肠杆菌反应,与其他5种菌株均不发生反应。在Westernblot试验中,2株mAb只与CFP-10蛋白发生反应,出现特异性条带。结果表明,mAb6E8、2E7是针对结核分枝杆菌CFP-10的特异性mAb。结论:成功地制备抗结核分枝杆菌CFP-10的mAb,它们在结核分枝杆菌诊断和致病机理研究等方面有重要应用价值。; 申峻松张辉张成全潘志明殷月兰焦新安; 关键词：结核分枝杆菌 CFP-10 单克隆抗体

重组沙门菌表达结核分枝杆菌ESAT-6及其特异性免疫应答分析被引量：1: 2009年; 目的分析重组沙门菌表达的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）分泌性蛋白ESAT-6诱导的特异性免疫应答。方法将ESAT-6蛋白编码基因导入原核表达载体pYA3333中，构建重组质粒pYA33-esat。通过电穿孔法转化减毒鼠伤寒沙门菌X4550，获得重组菌X4550（33-esat）。以每只10。CFU剂量的重组菌滴鼻免疫C57BL／6小鼠，间隔18d，在第2次免疫后10d取免疫小鼠脾脏、肺脏、肠系膜淋巴结（mesenteric lymph node，MLN）及派伊尔淋巴集结（Peyer‘s patch，PP）细胞，以ESAT-6多肽作为刺激原，检测特异性的IFN-γ分泌细胞和IL-4分泌细胞。同时，运用CFSE方法检测了体内抗原特异性CTL效应。结果经沙门菌表达并运送的Mtb抗原ESAT-6能诱导特异性的免疫应答。在肺脏及PP细胞中，检测到较高水平的IFN一1和IL_4分泌细胞，免疫应答以Th1型为主。而在脾脏和MLN中，免疫应答呈现Th1／Th2混合应答。此外，体内CTL试验表明，重组菌能够诱导抗原特异的CTL效应，且特异性杀伤率为69．9％。结论以滴鼻方式接种重组沙门菌，不仅能够诱导ESAT-6蛋白特异性的细胞免疫应答，还能激发特异的CTL效应，为结核病的防控提供了新的认识。; 张辉刘柳耿士忠胡茂志文科潘志明焦新安; 关键词：结核分枝杆菌 ESAT-6 滴鼻免疫细胞免疫应答

小鼠巨噬细胞系体外感染卡介苗的应答被引量：1: 2010年; 【目的】探讨小鼠巨噬细胞系RAW264.7体外感染卡介苗的应答。【方法】体外感染RAW264.7细胞23h后,分析细胞形态和细胞表面共刺激分子的表达。然后去除培养上清中的卡介苗,继续培养不同时间,通过CFSE、annexin V/PI和Rh123标记,分析宿主细胞的应答。【结果】卡介苗感染23h后,细胞生长状态良好,细胞内能明显观察到吞噬泡中的BCG。细胞表面共刺激分子CD40、CD54、CD80、CD86、CD11b的表达明显升高,CD11c、I-Ad以及H-2Kd的表达变化不明显。CFSE标记卡介苗后,随着培养时间的延长,荧光强度逐渐减弱,但是4天后仍然明显地高于对照组。除去培养上清中的卡介苗后继续培养,含有卡介苗的细胞逐渐减少,继续培养60h后基本检测不到。另外,卡介苗感染不能诱导细胞凋亡,线粒体膜电位先升高后降低,5d后,基本上与对照组一致。【结论】通过以上分析,为卡介苗免疫机理的研究提供了重要数据。; 胡茂志陈义芳韩璐季琰郑佳玉孟闯周海霞陈祥焦新安刘秀梵; 关键词：卡介苗 RAW264.7 共刺激分子线粒体膜电位

重组牛γ-干扰素单克隆抗体的研制被引量：14: 2009年; 为制备针对重组牛γ-干扰素(rBoIFN-γ)的单克隆抗体(mAb),以纯化的原核表达融合蛋白rHis-BoIFN-γ为免疫原,用纯化的rGST-BoIFN-γ为筛选抗原,应用淋巴细胞杂交瘤技术,研制抗rBoIFN-γ的mAb。结果获得13株稳定分泌抗BoIFN-γmAb的细胞株,命名为1C12、1F7、1G5、3E6、4D5、5E11、5G4、6F8、6G6、7E9、8D3、8F8和9G11。腹水的效价除单抗9G11外,其余效价都在1∶80 000以上;除5G4mAb亚类为IgG2b外,其余均为IgG1。Dot-ELISA结果表明,所得单抗只与融合蛋白rHis-BoIFN-γ和rGST-BoIFN-γ反应,而不与其它重组细胞因子和对照细菌反应,显示其良好的特异性。Western blot显示所获单抗能与相应的融合蛋白发生反应,出现特异性条带。同时所获单抗均能与牛IFN-γ标准品反应。13株单抗均为针对rBoIFN-γ的特异性mAb,为进一步研究rBoIFN-γmAb在牛的免疫调控、牛疫病的致病机制及其诊断中的应用奠定基础。; 张成全陈祥牛中伟杨卫冲徐正中孟闯潘志明黄金林焦新安; 关键词：原核表达单克隆抗体

嵌合鞭毛蛋白fliC/esat佐剂效应的研究被引量：1: 2011年; 目的:研究嵌合形式表达的鞭毛蛋白对结核分枝杆菌(MTB)抗原ESAT-6的免疫佐剂效应。方法:用PCR方法扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白基因fliCi及MTB抗原ESAT-6编码序列,通过重叠PCR将ESAT-6编码序列插入fliCi的高变区域,构建嵌合鞭毛基因片段fliC/esa。t将fliC/esat片段分别插入原核表达载体pET,构建pET-fliC/esat质粒。将ESAT-6编码序列插入原核表达载体pBCX的多克隆位点,构建原核表达质粒pBCX-esat。以质粒pET-fliC/esat及pBCX-esat分别转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基1-1硫代-β呋喃半乳糖苷诱导融合的嵌合蛋白fliC/esat及ESAT-6蛋白的表达。以抗ESAT-6 mAb HYB 076-08为一抗,通过W estern b lot鉴定嵌合蛋白fliC/esat及ESAT-6蛋白。以两种蛋白分别在体外刺激骨髓树突状细胞(BMDCs),通过FACS分析共刺激分子CD40、CD80、CD86和CD54的表达,同时用ELISA检测前炎性因子IL-12p70表达的水平。此外,以两种蛋白分别免疫C57BL/6小鼠,运用ELISPOT法分析ESAT-6特异的IFNγ-及IL-4分泌细胞的产生。结果:嵌合蛋白及ESAT-6蛋白均可溶性表达,相对分子质量(Mr)约为64000和39000。Western blot的结果显示,fliC/esat嵌合蛋白及ESAT-6蛋白均具有良好的反应原性。与ESAT-6蛋白相比较,fliC/esat嵌合蛋白在体外能诱导BMDCs成熟。IL-12p70的检测结果显示,fliC/es-at嵌合蛋白诱导BMDCs分泌的IL-12p70明显高于ESAT-6蛋白诱导分泌的IL-12p70(P<0.01)。体内实验结果表明,嵌合鞭毛蛋白免疫组能够显著增强ESAT-6特异性免疫应答,且免疫应答趋于Th1型。结论:鞭毛嵌合表达ESAT-6抗原,能够有效地上调BMDCs共刺激分子表达,增强ESAT-6特异性细胞的免疫应答,以嵌合形式表达的鞭毛蛋白对ESAT-6抗原具有诱导Th1型免疫应答的佐剂效应。; 张辉文科黄金林胡茂志申峻松潘志明焦新安; 关键词：ESAT-6 嵌合蛋白鞭毛蛋白佐剂

用小鼠模型分析表达牛结核分枝杆菌Ag85B重组腺病毒的细胞免疫特性被引量：7: 2010年; 【目的】构建表达牛结核分枝杆菌抗原Ag85B重组腺病毒rAd-Ag85B,并用小鼠模型分析其细胞免疫特点。【方法】采用PCR方法,扩增结核分枝杆菌Ag85B的编码基因fbpB,测序后构建pDC516-Ag85B重组质粒。利用脂质体将pDC516-Ag85B与pBHGfrtΔE1,3FLP共转染Ad293细胞包装成重组病毒rAd-Ag85B。空斑纯化后用电镜负染、目的基因转录和蛋白表达进行rAd-Ag85B验证。同时将rAd-Ag85B和rAd(wtAd)分别经皮下注射免疫BALB/c小鼠,二免二周后取小鼠脾脏细胞,进行CD69表面分子表达、淋巴细胞增殖和ELISPOT实验分析。【结果】在电镜下能观察到包装的重组病毒粒子,且在转录和蛋白水平上验证了rAd-Ag85B构建成功。免疫试验结果显示,rAd-Ag85B能激活CD4+T和CD8+T细胞表面分子CD69的表达,并引起淋巴细胞增殖。ELISPOT表明rAd-Ag85B呈现Th1免疫特点。【结论】成功构建的rAd-Ag85B能引起机体针对PPD蛋白或Ag85B多肽的Th1免疫应答。; 周海霞陈祥季琰周卫东胡茂志黄金林潘志明焦新安; 关键词：牛结核分枝杆菌重组腺病毒 Γ干扰素 CD69

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江苏省科技攻关计划(BE2007340)

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