广东省自然科学基金(06025825)
- 作品数：7 被引量：16H指数：2
- 相关作者：孙远明刘细霞王弘雷红涛沈玉栋更多>>
- 相关机构：华南农业大学广州军区广州总医院江西农业大学更多>>
- 发文基金：广东省自然科学基金国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学轻工技术与工程生物学更多>>
- 抗克伦特罗单链抗体表达载体的构建与鉴定被引量：5
- 2008年
- 为构建克伦特罗(Clenbuterol,CBL)单链抗体(scFv)表达载体,实现其在大肠杆菌中的表达。以pCANTAB5E-CBL质粒为模板,扩增CBL的scFv基因,与pPICZαA载体重组,然后以重组质粒pPICZαA-scFv为模板扩增scFv及其相连的6个组氨酸(6×His)片段,再与载体pBV220连接,转化大肠杆菌DH5α,阳性克隆质粒经酶切和PCR鉴定后进行目的片段的序列测定。重组菌经温度诱导表达重组单链抗体,并通过SDS-PAGE和Western blotting对其鉴定。采用竞争ELISA检测重组单链抗体的抗原结合活性。结果表明重组质粒pBV220-scFv含有插入片段,与原序列的同源性达99.8%。重组蛋白的分子量接近37kD,能够被抗His标签单克隆抗体特异性识别且可被游离的CBL竞争性抑制,IC50值为4.55ng/mL。这说明我们成功构建了重组质粒pBV220-scFv并实现了其在大肠杆菌中的表达,为进一步进行CBL免疫法快速检测奠定了一定的基础。
- 王弘梁艳杨金易刘细霞张宏斌雷红涛沈玉栋孙远明
- 关键词：克伦特罗原核表达
- 农药克百威单链抗体基因构建及蛋白结构模拟
- 2009年
- 构建小分子农药克百威(CBF)单链抗体(scFv)基因cbf,进行蛋白质二级、三级预测并对其理化特性进行分析。采用重叠延伸PCR方法,以能特异性分泌抗CBF单克隆抗体的杂交瘤细胞株5D3为原料,构建抗CBFscFv基因cbf,进行测序,采用生物信息软件对氨基酸序列推导并进行结构预测,同时对理化性质进行分析。结果得出,抗CBFscFv基因cbl全长750bp,对应228个氨基酸,单链抗体分子量约为26315.1,等电点预测值5.66,为酸性蛋白质;二级结构显示抗克伦特罗单链抗体含α螺旋18处,β折叠108处,β转角24处,随机卷曲93处。cbf三级结构建模显示VL和VH符合scFv的结构特点,可观察到6个环区形成疏水的"口袋",具有抗原结合位点的空间构象。从而构建了一个抗CBFscFv基因cbf,应用信息学技术所获得的预测和分析结果为抗克伦特罗单链抗体的进一步表达、纯化和活性研究提供了大量的信息。
- 刘细霞杨金易王弘庞杰雷红涛沈玉栋孙远明
- 关键词：克百威单链抗体
- 原核表达抗克伦特罗重组单链抗体及其纯化研究被引量：2
- 2009年
- 目的:原核表达抗克伦特罗重组单链抗体,对表达的包涵体蛋白进行提取和纯化,并鉴定重组抗体特性。方法:通过温度诱导大肠杆菌表达抗克伦特罗单链抗体,超声破碎菌体细胞,采用不同洗涤溶液提取包涵体。以不同变性剂溶解包涵体,Ni-NTA亲和柱纯化后,经脉冲稀释法将其复性。超滤及透析浓缩蛋白复性液,经Ni-NTA亲和柱二次纯化,得到纯化重组目的蛋白。通过SDS-PAGE电泳分析重组目的蛋白纯度,采用Western blotting和间接竞争ELISA对所制备的抗克伦特罗重组单链抗体特异性进行鉴定。结果:以大肠杆菌Es-cherichia coli BL21(DE3)为宿主菌诱导表达重组单链抗体,产率最高,占菌体蛋白的31%。以1mol/L尿素洗涤包涵体,6mol/L盐酸胍为变性剂,经Ni-NTA亲和柱纯化,所得复性重组单链抗体蛋白的纯度达96%。Western blotting分析显示,纯化并复性后的单链抗体可与鼠抗His标签蛋白单克隆抗体发生特异性的结合反应。间接竞争ELSIA结果表明,该重组抗体IC50值为3.35ng/mL,与沙丁胺醇等结构类似物无交叉反应。结论:原核表达制备的抗克伦特罗重组单链抗体具有较好的抗原结合活性及特异性,为进一步开展克伦特罗的免疫快速检测研究奠定基础。
- 王弘刘细霞梁艳张宏斌孙远明陈舒迟
- 关键词：克伦特罗单链抗体原核表达纯化
- 抗克伦特罗单链抗体基因构建及蛋白结构模拟被引量：2
- 2009年
- 目的:构建抗克伦特罗单链抗体(scFv)基因cbl,进行蛋白质结构模拟并对其理化特性进行分析。方法:采用重叠延伸PCR方法,以能特异性分泌抗克伦特罗mAb的杂交瘤细胞株5D1为原料,构建抗克伦特罗scFv基因cbl,进行测序,采用生物信息软件对氨基酸序列推导并进行结构预测,同时对理化性质进行分析。结果:抗克伦特罗scFv基因cbl全长720bp,对应225个氨基酸,单链抗体分子量约为25826.6,等电点预测值8.78,为碱性蛋白质;二级结构显示抗克伦特罗单链抗体含α螺旋20处,β折叠99处,β转角28处,随机卷曲93处。cbl三级结构建模显示重链(VH)和轻链(VL)形成一个疏水的"口袋",Linker游离于此结构之外,符合scFv的结构特点,明显具有抗原结合位点的空间构象,理论上应该具有良好的抗原结合活性。结论:构建一个抗克伦特罗scFv基因cbl,应用信息学技术所获得的预测和分析结果为抗克伦特罗单链抗体的进一步表达、纯化和活性研究提供信息。
- 王弘刘细霞潘科雷红涛沈玉栋孙远明
- 关键词：克伦特罗单链抗体
- 抗克伦特罗单链抗体基因工程菌株发酵条件的研究被引量：1
- 2009年
- 重组大肠杆菌BL21携带抗克伦特罗单链抗体(scFv)基因,研究了不同培养基、诱导时期、诱导时间、初始pH以及装液量对重组抗体表达量的影响,并对重组质粒稳定性进行研究。结果表明,在初始pH为7.2、装液量为25mL/250mL的LB培养基中,30℃培养菌体生长至A600nm为0.8时,42℃诱导表达6h,scFv表达量可达33.7%。工程菌在无选择压力条件下连续传代120代,保持稳定,100%的菌株携带重组质粒且经诱导后均有重组抗体的表达。
- 王弘梁艳刘细霞杨金易雷红涛沈玉栋孙远明
- 关键词：克伦特罗单链抗体工程菌
- 抗克伦特罗重组抗体发酵条件的优化
- 2009年
- 为提高抗克伦特罗(clenbuterol,CBL)单链抗体(single chian Fv,scFv)的表达量,考察了Mg2+、Ca2+、NH4+、NaHPO4-等无机离子,初始pH值以及装液量对重组抗体表达量的影响。优化试验结果表明,重组大肠杆菌E.coli BL21在初始pH值为7.2、含2 mmol/L Ca2+和20 mmol/L NaHPO4-的培养基中培养,装液量为25 mL,42℃诱导表达后抗CBL-scFv的表达量为33.7%。
- 梁艳王弘杨金易刘细霞徐小艳张宏斌雷红涛沈玉栋孙远明
- 关键词：克伦特罗发酵
- 快速检测技术在果蔬食品安全控制上的研究应用进展被引量：7
- 2012年
- 介绍了目前我国果蔬类食品中存在的主要食品安全问题,综述了化学比色、酶抑制技术、生物传感器、免疫学、分子生物学、生物芯片、ATP生物发光等食品安全快速检测技术在果蔬食品安全控制上的研究应用现状及发展趋势。
- 杨武英孙远明周杨吴民富
- 关键词：果蔬食品食品安全
