国家自然科学基金(30872621)
- 作品数：4 被引量：15H指数：3
- 相关作者：袁玫卢世璧彭江许文静汪爱媛更多>>
- 相关机构：中国人民解放军总医院沧州市中心医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家科技支撑计划国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 绿色荧光蛋白和Nel1型蛋白基因共表达腺病毒载体的构建及体外转染大鼠BMSCs的初步实验研究被引量：6
- 2010年
- 目的构建同时表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)报告基因和人类Nel1型蛋白[homo sapiens NEL-like1,NELL1)]基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-NELL1,并转染大鼠BMSCs,观察其表达情况,为进一步研究NELL1蛋白的成骨作用提供理论基础。方法设计特异性引物从NELL1质粒中扩增NELL1,将测序正确的片段用XhoI/BglII酶切处理,定向插入至pShuttle-GFP-CMV(-)TEMP重组穿梭载体,然后将验证正确的重组穿梭质粒中的插入片段转移至pAdxsi载体构建重组腺病毒载体质粒,用PacI限制性内切酶线性化后转染HEK293细胞,扩增纯化重组腺病毒,半数组织培养感染量法测定重组腺病毒滴度。培养大鼠BMSCs,采用流式细胞仪鉴定表面标志物,并行成骨、成脂诱导鉴定。用构建的pAdxsi-GFP-NELL1及空病毒pAdxsi-GFP(作为对照)转染鉴定正确的BMSCs,RT-PCR检测NELL1的表达,免疫荧光检测GFP基因及NELL1的表达情况,细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)法检测对细胞增殖的影响。结果成功构建同时表达NELL1和GFP基因的重组腺病毒载体(pAdxsi-GFP-NELL1),纯化后获得滴度达1×1011pfu/mL的重组腺病毒。成功分离获得大鼠BMSCs并传代、纯化,经流式细胞仪鉴定表面标志物及成骨、成脂诱导鉴定为BMSCs。pAdxsi-GFP-NELL1转染BMSCs后,RT-PCR检测示NELL1mRNA阳性表达,荧光显微镜观察示细胞爬片GFP阳性表达,NELL1抗体免疫荧光观察示NELL1蛋白阳性表达。CCK-8法鉴定显示转染后对BMSCs生长无明显影响。结论构建并纯化后的重组腺病毒载体(pAdxsi-GFP-NELL1)可高效转染大鼠BMSCs,并稳定表达NELL1和GFP两种基因,为进一步研究新的成骨基因NELL1的作用,追踪其在体内、体外表达情况提供了新工具。
- 薛静彭江张莉刘舒云陈继凤汪爱媛袁玫许文静卢世璧
- 关键词：BMSCS重组腺病毒载体绿色荧光蛋白
- 活体小动物Micro-CT动态评价大鼠股骨牵张成骨被引量：6
- 2010年
- [目的]利用活体小动物Micro-CT可连续观察大鼠股骨牵张成骨(distraction osteogenesis,DO)的优点,观察DO的不同时期骨愈合的模式,为寻找加速DO的愈合速度和带架方法提供指导。[方法]通过应用自行研制的大鼠股骨DO外固定架系统,对12只大鼠制备股骨DO模型,术后截骨端加压固定7d(静息期),第8d开始按0.25mm/12h的速度牵引延长共14d,延长7mm(延长期)。术后第21d延长结束后,用可透X线的高分子夹板材料替换金属外固定架,再固定35d(巩固期)。术后第28、42d分别处死2只大鼠用于组织学检查,其余8只大鼠分别于术后第21、28、42、56d麻醉后行X线及活体Micro-CT检查,并于术后56d取材,对其中5只行生物力学测试,余3只用于组织学检查。[结果]在DO静息期及延长期,延长区无明显新骨形成,延长区内主要为由纤维样组织组成的假性生长板结构。在巩固期前期(21d以内)主要为骨量的增加,表现为骨矿含量增加,骨小梁数量增多;巩固期21d以后,骨量仍持续增加,同时骨的质量也开始明显提高,表现为骨小梁增厚,已矿化组织矿化度提高。在术后56d(延长结束后5周)后,延长区内仍处于成骨和骨结构的改建中,假性生长板基本消失,未骨化的软骨组织依然存在。术后56d,DO侧股骨的最大扭矩及失效能量均小于健侧股骨。[结论]①在大鼠股骨DO延长结束后应用可透X线的高分子夹板固定牵引针可以获得稳定的固定;②改进大鼠股骨DO模型的固定方式后,Micro-CT可用于活体动态观察及评价其新骨形成;③长骨牵张成骨中骨量的增加自延长结束后开始,持续5周以上,骨质量的改建在延长结束后2～3周才开始,二者的发生具有时相性,提示相应的干预手段应在不同的时期进行;④对DO的全面观察应长于术后56d或延长结束后5周。
- 薛静彭江汪爱媛袁玫眭翔赵斌王玉范猛郭全义许文静卢世璧
- 关键词：牵张成骨骨化
- 腺病毒介导NELL1促进骨溶解后的高质量骨再生被引量：3
- 2012年
- [目的]研究具有特异性成骨作用的NELL1因子对磨屑所致骨溶解的影响,为骨溶解病的治疗提供一种新方案。[方法]建立聚乙烯(Polyethylene,PE)颗粒诱导的颅骨骨溶解模型,68只Balb/c小鼠随机分成4组,即假手术组:术后1 d颅顶皮下注射0.1 ml生理盐水;颗粒对照组:植入10 mg PE颗粒,术后1 d注射0.1 ml生理盐水;实验组(Ad-GFP-NELL1组):植入10 mg PE颗粒,术后1 d注射0.1 ml(109 pfu)NELL1荧光重组腺病毒载体(Ad-GFP-NELL1);安慰剂组(Ad-GFP组):植入10 mg PE颗粒,术后1 d注射0.1 ml(109pfu)荧光重组腺病毒载体(Ad-GFP)。术后10 d采用活体荧光成像检测NELL1及GFP表达情况,并于处死后进行Micro-CT、组织学及生物力学的检测。[结果]活体荧光证实实验组与安慰剂组小鼠颅顶有NELL1及GFP的高度表达,Micro-CT 3D图像观察实验组小鼠的颅骨骨溶解所致骨量丢失明显减少,所选兴趣区(ROI)的骨体积(BV)、骨密度(BMD)、骨小梁厚度(Tb.Th.3D)、骨表面积体积比(BS/BV)均明显优于对照组及安慰剂组。组织学切片观察到实验组的骨再生明显增多。另外,实验组小鼠的颅骨弹性模量[(2.50±0.12)MPa]也明显优于对照组[(0.60±0.20)MPa]及安慰剂组[(0.82±0.09)MPa](OP<0.01)。[结论]腺病毒介导表达的成骨因子NELL1能通过促进高质量的骨再生平衡磨屑所致骨溶解的骨量丢失,是治疗骨溶解的一种潜在性解决方案。
- 郭旭彭江王玉赵斌袁玫孟昊业张莉张新立许文静汪爱媛卢世璧
- 关键词：骨溶解磨屑骨再生
- Nell-1基因促进成骨作用的研究及应用进展
- 2010年
- Nell-1是近年来新发现的一种具有促进成骨作用的细胞因子,动物实验及体外实验表明,Nell-1可特异性地促进成骨细胞成熟,促进矿化.其促分化作用强于促增生作用,可使新形成的骨组织更致密,力学强度更大.
- 薛静卢世璧袁玫
- 关键词：成骨作用基因促进体外实验动物实验细胞成熟增生作用
