国家自然科学基金(30700902)
- 作品数：1 被引量：3H指数：1
- 相关作者：余文博武欣孙庆文陈春妹徐丛剑更多>>
- 相关机构：复旦大学更多>>
- 发文基金：上海市青年科技启明星计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 转座子piggyBac介导的HSV-tk基因在妇科恶性肿瘤细胞中长期稳定表达的研究被引量：3
- 2010年
- 目的 研究piggyBac（PB）转座子介导转移外源基因HSV-tk在多种妇科恶性肿瘤细胞中的表达情况,探讨其作为一种可整合的非病毒载体在肿瘤基因治疗中的应用价值.方法 通过PCR技术扩增HSV-tk基因的编码区,定向克隆至PB表达载体PB[Act-RFP]DS,经酶切、测序鉴定为重组载体PB[Act-RFP,HSV-tk]DS（pPB/TK）.联合3种小同的转染试剂FuGENE HD、jetPEI及lipofectamine 2000,分别将pPB/TK转染入4种常见的妇科恶性肿瘤细胞株HeLa、JEG-3、SKOV3和HEC-1B.转染后以mRFP1为报告基因,经荧光显微镜观察和流式细胞仪分析转染效率;逆转录（RT）-PCR技术检测HSV-tk和mRFP1基因的表达;四甲基偶氮唑蓝实验测定不同浓度的更昔洛韦（GCV）对转染后细胞的杀伤作用.转染后细胞经流式细胞仪分选,极限稀释单克隆培养建立稳定转染株,并以反向PCR技术确定转座子插入基因组的位点.结果 （1）成功构建重组载体pPB/TK.（2）在3种转染试剂的辅助下,pPB/TK均可有效转染入HeLa、HEC-1B、SKOV3和JEG-3细胞;不同转染试剂辅助下pPB/TK在同种细胞中的转染效率各不相同,在HeLa细胞中,FuGENE HD的转染效率[（78.7±9.2）%]高于lipofectamine 2000[（54.1±11.4）%]和jetPEI][（46.5±7.4）%],分别比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）;同一转染试剂辅助下pPB/TK在不同细胞中的转染效率也不相同,以FuGENE HD为转染试剂,pPB/TK在HeLa、JEG-3和SKOV3细胞中的转染效率分别为（78.7 ±9.2）%、（74.4±8.9）%和（83.2±9.7）%,高于HEC-1B细胞的（39.5±8.7）%,分别比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）.（3）RT-PCR结果显示,4种细胞均有HSV-tk和mRFP1基因mRNA的表达.（4）GCV对转染有pPB/TK的HeLa、JEG-3、SKOV3和HEC-1B细胞的半数抑制浓度分别为1.29、3.35、0.09和13.28 μg/ml.10μg/ml GCV对转染有pPB/TK的SKOV3细胞抑制率高于单独转染pORF-HSVtk者,细胞抑制率分别为（86±9）%和（52±12）%,两者比较,差异有�
- 康玉孙庆文余文博程明军张晓燕武欣陈春妹郑煜芳徐丛剑
- 关键词：单纯疱疹病毒属胸苷激酶发光蛋白质类
