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胰岛素对脂肪干细胞生长因子分泌功能的影响被引量：4: 2009年; 目的了解不同浓度胰岛素对脂肪于细胞（ADSC）分泌生长因子功能的影响。方法获取人腹部脂肪组织分离培养ADSC，选择第3代细胞经免疫表型鉴定及脂源性诱导分化鉴定。根据培养液中胰岛素浓度，将ADSC分为1×10^-8、1×10^-7、1×10^-6mol／L3个实验组，常规培养至70％融合时，更换为含不同浓度胰岛素的无血清DMEM培养液培养3d。设无胰岛素培养液培养的ADSC为对照组。采用酶联免疫吸附测定法，测定ADSC的血管内皮生长闪子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）分泌量；应用噻唑蓝比色法和羟脯氨酸比色法，检测ADSC上清液对Fb增殖及胶原合成的影响。结果1×10^-8、1×10^-7mol／L胰岛素组ADSC的VEGF、HGF分泌量分别为（471±41）、（762±66）ng／L和（643±64）、（930±67）ng／L，与对照组（286±47）、（577±84）ng／L比较，其含量显著增加（P〈0．05或P〈0．01）；而1×10^-6mol／L胰岛素组ADSC的VEGF、HGF分泌量无明显变化（P〉0．05）。1×10^-8、1×10^-7mol／L胰岛素组ADSC培养上清液有明显的促Fb增殖及胶原合成作用，以1×10^-7mol／L组作用更显著（P〈0．05或P〈0．01）。结论1×10^-8、1×10^-7mol／L胰岛素能显著促进ADSC分泌VEGF和HGF。; 折涛胡大海张军刘佳琦张万福蔡维霞赵周婷汤朝武; 关键词：胰岛素干细胞成纤维细胞胶原合成

人脂肪干细胞分泌因子对HaCaT细胞的生物学作用: 2009年; 目的:分离培养脂肪干细胞(ADSCs)以探讨其分泌因子对HaCaT细胞的生物学作用.方法:从人腹部脂肪组织中分离并培养ADSCs3d后,ELISA法测定ADSCs分泌血管内皮生长因子(VEGF),肝细胞生长因子(HGF)含量;收集ADSCs培养液(ADSC-CM)作用于HaCaT细胞株.采用MTT法测定HaCaT细胞的增殖;AnexinV/PI双染色法测定HaCaT细胞的凋亡情况;体外细胞划痕法测定其迁移能力.结果:培养获得ADSCs细胞3d后,培养液中VEGF、HGF含量分别为(287±47),(577±85)ng/L.MTT实验30%ADSC-CM组、50%ADSC-CM组的A490nm值分别高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01).实验组HaCaT细胞凋亡率明显低于对照组(P<0.05).与对照组相比较,实验组HaCaT细胞迁移距离36,48h时间点显著增大(P<0.05或P<0.01).结论:ADSCs能分泌细胞因子且对HaCaT细胞具有促增殖、迁移和抑制凋亡作用.; 折涛刘佳琦张军张万福蔡维霞白哓智胡大海; 关键词：脂肪干细胞 HACAT细胞凋亡

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及多向诱导分化被引量：18: 2010年; 背景:间充质干细胞不仅自身免疫原性弱,还可以调节细胞免疫功能,减轻移植物排斥反应,在组织工程中具有良好的应用前景。但骨髓中间充质干细胞含量稀少,约占单个核细胞的十万分之一到百万分之一。目的:建立一种分离、培养扩增兔骨髓间充质干细胞的方法,观察体外培养骨髓间充质干细胞的生长特性,及其潜在的诱导分化能力。方法:采用灌流法获取兔胫骨骨髓,密度梯度离心法联合贴壁培养法体外纯化扩增,相差显微镜观察其形态学特点,MTT法测定绘制传代骨髓间充质干细胞生长曲线,经成骨诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,0.1μmol/L地塞米松,200μmol/L抗坏血酸,10mmol/Lβ-甘油磷酸钠)、成脂诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,1μmol/L地塞米松,200μmol/L吲哚美辛,0.5mmol/LIBMX,10mg/L胰岛素)、成软骨诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,10μg/L转化生长因子β1,0.1μmol/L地塞米松,50μmol/L抗坏血酸,6.25mg/L胰岛素)体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化,并分别经碱性磷酸酶染色、油红O染色和甲苯胺蓝染色法鉴定。结果与结论:通过密度梯度离心法联合贴壁培养法可在体外大量扩增、纯化骨髓间充质干细胞,所获细胞具有高度自我更新能力和多向分化潜能,原代及传代骨髓间充质干细胞为梭形。经成骨细胞诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性;经成脂肪细胞诱导,细胞内出现红色脂滴,经成软骨细胞诱导,甲苯胺蓝染色阳性。; 徐成峰胡大海赵周婷张万福白晓智蔡维霞; 关键词：间充质干细胞细胞培养分化骨髓间充质干细胞

热损伤角质形成细胞培养上清液对成纤维细胞生物学行为的影响被引量：4: 2010年; 目的了解KC热损伤后培养上清液对真皮Fb生物学行为的影响.方法分离培养人真皮Fb,另建立KC（选用HaCaT细胞）热损伤模型.收集正常堵养及热损伤后12 h的KC培养上清液,用无血清DMEM以1：1体积比稀释,分别制成正常KC和热损伤KC 2种条件培养液.将Fb分别用无血清DMEM和2种条件培养液培养：（1）于培养12、24、36、48 h时,采用噻唑蓝法检测Fb增殖活性;（2）于培养12 h时,用流式细胞术检测Fb的凋亡情况（Fb预先致热损伤,并增设Fb伤后无处理对照）;（3）培养24 h时,用免疫荧光法检测Fb胞质α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达情况,并用实时定量PCR法测定Fb α-SMA mRNA的表达.对实验结果进行单因素方差分析,用LSD-t检验行组间两两比较.结果（1）Fb增殖活性：Fb经热损伤KC条件培养液培养12、24、36、48 h时,其吸光度值均高于同时相点用无血清DMEM培养的Fb（t值分别为1.89、2.35、2.02、1.94,P值均小于0.01）;其中12、24、48 h时与用正常KC条件培养液培养的Fb比较,差异有统计学意义（12 h时t=1.83,P〈0.01;24 h时t=2.91,P〈0.05;48 h时t=1.83,P〈0.05）.（2）Fb凋亡检测：热损伤KC条件培养液培养的Fb与正常KC条件培养液培养以及伤后无处理的Fb比较,凋亡率均明显下降（t=3.31,P〈0.05;t=1.47,P〈0.01）.（3）Fb胞质α-SMA表达：荧光显微镜下可见,用无血清DMEM或正常KC条件培养液培养的Fb中,α-SMA阳性表达（红色荧光）细胞较少;热损伤KC条件培养液培养的Fb中,α-SMA阳性表达细胞明显增多.（4）α-SMA mRNA表达：热损伤KC条件培养液培养的Fb α-SMA mRNA相对表达量为1.32±0.06,高于正常KC条件培养液培养的Fb（1.14±0.07,t=2.51,P〈0.05）和无血清DMEM培养的Fb（1.00±0.09,t=1.77,P〈0.05）.结论 KC热损伤后12 h培养上清液可明显促进Fb增殖、抑制Fb凋亡、促进Fb向肌成纤维细胞转分化.; 白晓智胡大海张万福张战凤石继红蔡维霞朱华宇朱雄翔汤朝武; 关键词：成纤维细胞细胞转分化角质形成细胞

人表皮干细胞改良培养及其组织工程皮肤的构建被引量：10: 2011年; 目的:改良传统人表皮干细胞(hESCs)分离、培养方法,为组织工程皮肤构建提供产率更高、活力更好的种子细胞。方法:应用改良的酶消化法(改良法)及传统酶消化法(传统法)分离、培养hESCs,倒置显微镜观察细胞形态,MTT法绘制生长曲线、免疫组化法测定hESCs标志物角蛋白19(K19)和β1整合素的表达,并且进一步比较上述两种方法所获种子细胞构建的组织工程皮肤的形态学的特性。结果:台盼蓝染色显示改良法细胞消化分离数为92.25±15.61个,传统法细胞消化分离数为68.50±26.91个(P<0.01);改良法活细胞比率是(94±0.01)%,传统法活细胞比率是(75±0.04)%(P<0.05)。在8天时改良法细胞MTT法OD值为1.300,传统法为0.779,改良法较传统法活力好,增殖快;细胞免疫组织化学染色显示表皮干细胞标志物角蛋白19(K19)和β1整合素均为阳性染色;HE染色结果显示采用改良法hESCs构建的组织工程皮肤表皮细胞复层层数为5～6层、基底细胞排列整齐,传统法hESCs构建的组织工程皮肤表皮细胞复层层数为3～4层、基底细胞排列散乱。结论:利用改良的酶消化法可获得数量更多、活力更好的人表皮干细胞,为以hESCs为种子细胞构建组织工程皮肤奠定基础。; 张彦刚胡大海张战凤蔡维霞朱华宇折涛; 关键词：表皮干细胞酶消化法组织工程皮肤

胰岛素干预后脂肪来源干细胞分泌功能对HaCaT细胞生物学影响被引量：3: 2009年; 目的分离培养脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),探讨胰岛素刺激前后其分泌因子的变化及对人角质形成细胞株HaCaT细胞生物学影响。方法从腹部外科手术患者自愿捐献皮下脂肪组织中分离、培养ADSCs,取第3代ADSCs调整密度为5×104个/mL,采用1×10-7mol/L胰岛素刺激作为A组,以未加胰岛素刺激作为B组,培养3d后收集两组ADSCs培养上清液(conditioned medium of ADSCs,ADSC-CM),ELISA法测定其VEGF、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)含量。取人角质形成细胞株HaCaT细胞培养,将第4代细胞根据培养液不同分为4组。A1组:含A组ADSC-CM和2FBS各0.5mL;B1组:含B组ADSC-CM和2FBS各0.5mL;C1组:1mL含终浓度为1×10-7mol/L胰岛素的2FBS;D1组:仅含2FBS1mL。培养3d采用MTT法测定HaCaT细胞增殖情况;培养12hAnnexinV-FITC双染测定细胞凋亡情况;培养0、12、24、36、48h采用体外细胞划痕法测定其迁移能力。结果A组VEGF、HGF含量分别为(643.28±63.57)、(929.95±67.52)pg/mL,B组分别为(286.52±46.68)、(576.61±84.29)pg/mL,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。细胞增殖测定A1、B1组吸光度值分别为0.881±0.039、0.804±0.041,与C1组(0.663±0.027)及D1组(0.652±0.042)比较,差异有统计学意义(P<0.01);A1组高于B1组(P<0.05)。A1、B1组凋亡率分别为5.23±1.98、8.82±2.59,均低于C1组(31.70±8.85)和D1组(29.60±8.41),差异有统计学意义(P<0.05),但B1组凋亡率高于A1组(P<0.05)。A1、B1、C1和D1组36h迁移距离分别为(0.1846±0.0192)、(0.1598±0.0294)、(0.0592±0.0176)及(0.0582±0.0123)mm,48h分别为(0.2318±0.1740)、(0.2051±0.0121)、(0.0792±0.0081)及(0.0784±0.0117)mm,两时间点A1组和B1组距离明显大于C1组和D1组(P<0.01),A1组大于B1组(P<0.05);其他时间点迁移距离差异无统计学意义(P>0.05)。结论胰岛素干预后ADSCs能更有效促进HaCaT细胞增殖、迁移和抑制凋亡。; 折涛胡大海张军张万福刘佳琦陈刚蔡维霞张战凤; 关键词：胰岛素脂肪来源干细胞 HACAT细胞

热损伤角质形成细胞培养上清对真皮成纤维细胞增殖与胶原mRNA表达的影响被引量：3: 2011年; 目的观察热损（创）伤后角质形成细胞（KC）培养上清对真皮成纤维细胞（Fb）增殖与胶原mRNA表达的影响.方法建立KC热损伤模型,收集正常及热损伤12 h后培养上清配制不同浓度的细胞条件培养液;分离培养人正常Fb,实验组分别加入含不同浓度的细胞条件培养液,以单纯DMEM组为对照,采用噻唑蓝（MTT）比色法测定24 h后真皮成纤维细胞增殖;分别以流式细胞仪、实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）测定DMEM组、50%浓度条件培养液组相同时间Fb生长周期及Ⅰ型胶原mRNA表达.结果细胞增殖测定：热损伤上清（10%、30%、50%、70%）条件培养液组A值（0.151±0.004、0.165±0.009、0.195±0.006、0.202±0.008）均高于正常上清（10%、30%、50%、70%）条件培养液组（0.144±0.004,0.159±0.002,0.180±0.005,0.181±0.006）及对照组（0.144±0.007）,除10%浓度组外各实验组A值与对照组比较差异均有统计学意义（t值分别为：4.01、11.42、11.41;P＜0.05）,热损伤上清与正常上清条件培养液组比较：50%、70%浓度组间差异有统计学意义（t值分别为：2.03、1.94;P＜0.05）;热损伤上清条件培养液50%与70%浓度组间差异无统计学意义（t值为1.34;P＞0.05）.细胞周期测定见50%浓度热损伤上清组可明显促进Fb通过G1/S及S/G2限制点,S期及G2/M期细胞与对照组比较增多,G0/G1期细胞与对照组比较明显减少（t值分别为：5.87、11.3、4.86;P＜0.05）.Ⅰ型胶原mRNA表达测定中,50%浓度热损伤上清组与对照组比较表达明显上调,差异亦有统计学意义（t=1.72;P＜0.05）.结论热损（创）伤后KC上清液可促进Fb的增殖,同时可上调Ⅰ型胶原mRNA的表达.; 白晓智胡大海石继红蔡维霞张战凤朱华宇朱雄翔汤朝武; 关键词：热损伤角质形成细胞细胞增殖胶原

ADSCs培养上清液对成纤维细胞的生物学影响被引量：12: 2008年; 目的:分离培养脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),探讨其培养上清液对成纤维细胞的生物学作用。方法:从人腹部脂肪组织中分离、培养ADSCs,收集其上清液培养人成纤维细胞。MTT法测定成纤维细胞的增殖;AnexinⅤ/PI双染色法测定成纤维细胞的凋亡;体外细胞划痕法测定其迁移能力。结果:培养获得ADSCs,ADSCs培养上清液实验组成纤维细胞的增殖及迁移均明显大于对照组(P<0.05或P<0.01);同时其凋亡率也低于对照组(P<0.05)。结论:ADSCs培养上清液能促进成纤维细胞的增殖、迁移及抑制凋亡发生。; 折涛胡大海张万福张军刘佳琦蔡维霞朱华宇汤朝武; 关键词：脂肪干细胞成纤维细胞凋亡

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国家自然科学基金(30772249)

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