云南省自然科学基金(2009ZC187M)
- 作品数：7 被引量：12H指数：2
- 相关作者：孙强明杨丽娟赵玉娇陈俊英潘玥更多>>
- 相关机构：中国医学科学院北京协和医学院北京协和医学院昆明医科大学更多>>
- 发文基金：云南省社会发展科技计划云南省自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- Ⅲ型登革病毒D9964株在人胚肺二倍体细胞KMB17上适应株选育纯化及其增殖动力学研究被引量：1
- 2013年
- 选育出Ⅲ型登革病毒中国株在人胚肺二倍体细胞KMB17上的适应株并对其生物学特性和增殖动力学进行研究,为研究登革病毒减毒活疫苗奠定基础。Ⅲ型登革病毒中国株D9964经RT-PCR鉴定型别正确后,进行毒种扩增和滴度测定;以4.0MOI接种KMB17细胞,反复传代直至病毒能在细胞中适应和增殖;连续传10代,选育出KMB17细胞适应株,经三轮噬斑纯化筛选适应株,微量滴定法检测10代病毒培养液的感染性滴度;免疫荧光法检测纯化病毒株的抗原性;将病毒纯化株接种KMB17细胞,取第3～7d细胞提取RNA,以Real-time PCR检测病毒适应株在细胞中的增殖动态。结果显示,经适应性培养后Ⅲ型登革病毒中国株D9964能在KMB17细胞中稳定增殖,经噬斑纯化获得了高纯度的细胞适应株,病毒保持了原始毒株良好的抗原性;增殖动力学研究显示第5～6d为病毒在细胞内的增殖高峰期。
- 赵玉娇潘玥阎玲梅岳耀斐杨丽娟陈俊英马绍辉施海晶孙强明
- 关键词：登革病毒人胚肺二倍体细胞适应性增殖动力学
- 头颈部鳞状癌肿瘤干细胞的研究进展
- 2013年
- 全世界每年头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）新发病例约50万，且位居所有癌症病死率的第6位，而目前尚无合适的治疗方法。研究证实，HNSCC中存在肿瘤干细胞（cancerstemcells，CSCs），这种细胞具有自我更新及分化能力。当前主要采用化疗与放疗的结合来治疗HNSCC，
- 仲志磊孙强明
- 关键词：头颈部鳞状细胞癌肿瘤干细胞CARCINOMAHNSCC新发病例
- Ⅱ型登革病毒D01090株在人胚肺二倍体细胞KMB17上适应株选育及初步鉴定
- 2012年
- 目的:选育能在人胚肺二倍体细胞KMB17上稳定增殖的Ⅱ型登革病毒适应株,为研发以人源性细胞为基质的登革疫苗候选株奠定基础。方法:将Ⅱ型登革病毒中国株D01090提取病毒基因组,通过RT-PCR法进行登革病毒型别鉴定后,在C6/36和Vero细胞上进行毒种扩增和滴度测定;将D01090毒株以4.0MOI接种KMB17细胞并反复传代至病毒完全适应在细胞内扩增,并连续传代10代,选育出良好的KMB17细胞适应株;病毒培养液经蔗糖梯度离心和超速离心后获得高浓度病毒液,接种KMB17细胞后通过透射电镜超薄切片检测细胞的病理变化;然后经过三轮蚀斑纯化筛选出纯化病毒株,免疫荧光法检测病毒纯化株的抗原性。结果:以Ⅱ型登革病毒中国株D01090基因组为模板,能扩增出511bp的登革病毒特异基因和119bp的Ⅱ型登革病毒型特异性基因。病毒经C6/36细胞扩增后滴度达4.5CCID50/ml,感染KMB17细胞至第三代可产生明显的细胞病变(cytopathic effect,CPE),连续传10代细胞病变速度逐渐增快,至第10代达到增殖高峰,病毒滴度达5.0CCID50/ml;将病毒感染6天后病变达+++的KMB17细胞进行超薄切片后经透射电镜观察细胞的病理变化,镜下可观察到内质网中新组装成的病毒颗粒,细胞周围产生很多分裂的小碎片,伴有游离出胞的病毒;三轮蚀斑纯化后筛选出纯化克隆,免疫荧光法检测病毒的抗原性呈阳性。结论选育出了能稳定传代且病毒扩增量高的Ⅱ型登革病毒KMB17细胞适应株,经蚀斑纯化后仍保持较好的抗原性。
- 赵玉娇潘玥阎玲梅岳耀斐杨丽娟孙强明
- 关键词：生物学特性
- 重组Ⅱ型登革病毒NS1的表达及其免疫原性的研究被引量：1
- 2014年
- 目的:表达制备重组Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1,检测该重组表达蛋白的免疫原性,为检测试剂盒的研制提供基础。方法:根据Ⅱ型登革病毒NS1蛋白基因序列(GenBank登录号:NC_001474),对基因序列进行编码密码子优化后进行全基因合成,随后,经双酶切将目的片段克隆到表达载体pET28a上,通过IPTG诱导表达;表达产物经Western blot鉴定后,进一步进行蛋白纯化和透析复性,制备获得重组Ⅱ型登革病毒NS1蛋白。收获的NS1蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,通过间接酶联免疫学方法测定其效价,检测其免疫原性。结果:成功构建了Ⅱ型登革病毒NS1蛋白的表达载体。Western blot显示表达的重组蛋白能够被NS1单抗特异性的结合,纯化复性后的重组蛋白在小鼠体内表现出良好的免疫原性。结论:重组表达的NS1蛋白有良好的免疫原性,为以后的NS1单克隆抗体的制备和登革病毒检测试剂盒的研制提供了良好的基础。
- 李多杨丽娟赵玉娇潘玥陈俊英付娟娟黄新伟邱丽娟孙强明
- 关键词：登革病毒重组蛋白NS1蛋白免疫原性ELISA
- Ⅳ型登革病毒中国株LD34在KMB17细胞上的适应性及其生物学特性被引量：1
- 2012年
- 目的研究Ⅳ型登革病毒中国株LD34在人胚肺二倍体细胞KMB17上的传代适应性及其生物学特性。方法将Ⅳ型登革病毒中国株LD34在C6/36细胞上扩增,并采用微量细胞病变法测定病毒的感染性滴度。以2.0 MOI的病毒接种KMB17细胞传代培养,筛选KMB17细胞适应株,并进行培养条件的优化。将Ⅳ型登革病毒中国株LD34 KMB17细胞适应株连续传10代,测定病毒的感染性滴度,免疫荧光法检测病毒的抗原性,RT-PCR法扩增登革病毒的特异性基因。结果筛选出的Ⅳ型登革病毒中国株LD34在KMB17细胞上的最佳培养条件为病毒接种MOI 0.4,培养基血清浓度5%;其感染KMB17细胞后可产生明显的细胞病变(CPE),连续传10代,病毒滴度达7.75 CCID50/ml;第10代病毒的抗原性呈阳性;第10代病毒能扩增出511 bp的登革病毒特异性基因和393 bp的Ⅳ型登革病毒特异性基因。结论获得了Ⅳ型登革病毒中国株LD34 KMB17细胞适应株,病毒保持了原始毒株的基本生物学特性,且具有较好的抗原性。
- 赵玉娇龙海亭潘玥陈俊英杨丽娟岳耀斐孙强明
- 关键词：登革病毒人胚肺二倍体细胞适应性生物学特性
- 云南省3000例妇女宫颈人乳头瘤病毒的检测与基因分型被引量：6
- 2012年
- 目的探讨云南省妇女宫颈人乳头瘤病毒(HPV)感染状况、亚型及年龄分布,为该地区预防HPV感染和防治宫颈癌提供科学依据。方法收集2010年7月至2011年12月云南省各地市州县送检至昆明医学院第一附属医院及于该院妇产科门诊就诊并自愿接受宫颈HPV检查者宫颈标本3000例为研究对象,年龄为18～75岁。通过提取HPV DNA后,通过巢式PCR,美国国立生物技术信息中心(NCBI)BLAST序列比对等方法分析HPV-DNA亚型、感染率和年龄分布(本研究遵循的程序符合中国医学科学院北京和医学院医学生物学研究所人体试验委员会制定的伦理学标准,得到该委员会批准)。结果自3000例受试对象中,共计检出646例HPV呈阳性者,感染率为21.53%。其中高危型HPV(HR-HPV)为476例(73.68%,476/646),以HPV-16(33.59%,217/646),-58(22.45%,145/646),-33(8.51%,55/646)为主;低危型HPV(LR-HPV)为170例(26.32%,170/646),以HPV-6(12.54%,81/646),-81(7.74%,50/646),-11(4.43%,28/646)为主。HPV感染的高峰年龄为29～39岁(44.27%,286/646)。结论 HPV基因亚型分布具有一定地域性,云南省妇女宫颈HPV感染最常见类型为HPV-16,-58,-6。HPV-DNA分型检测在宫颈癌的临床诊断和预后方面具有重要意义。
- 岳耀斐杨丽娟陈俊英潘岳赵玉娇孙强明
- 关键词：人乳头瘤病毒巢式PCR测序基因分型
- 云南省人乳头状瘤病毒16型E6/E7基因的变异分析被引量：3
- 2012年
- 研究人乳头状瘤病毒16型E6和E7基因在云南省的变异情况。采集获得2 000例妇科门诊样品,提取DNA,以MY09/MY11为外引物,GP5+/GP6+为内引物,采用nest-PCR法对样品HPV-DNA高变区L1区的相应基因进行扩增、测序和分型,筛选得到20例HPV-16型病毒DNA,对其进行E6和E7基因特异性扩增,测序。结果显示20例HPV-16型E6基因中有10例在178位核苷酸发生碱基突变,突变频率为50%,E7基因中有10例在647位核苷酸发生碱基突变,突变频率为50%。进化树分析结果表明在云南省流行的HPV-16型中主要为亚洲变异型,没有发现非洲1型,非洲2型。
- 杨丽娟岳耀斐陈俊英潘玥赵玉娇马绍辉孙强明
- 关键词：HPV-16基因变异E6基因E7基因
