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IL-21的生物学功能及其在病毒感染中的作用被引量：1: 2011年; IL-21是最近发现的一种Ⅰ型细胞因子，由活化的CD4^＋T细胞产生，特别是Th2细胞。IL-21R存正常的淋巴组织包括脾、胸腺、淋巴结、外周血淋巴细胞、纤维化肺组织中都有表达。IL-21特异性结合IL-21R介导多种生物学效应，对不同阶段B、T淋巴细胞的分化和自然杀伤（NK）细胞的增殖均起重要作用。因此IL-21有着广泛的生物学功能，在各种疾病包括病毒感染中扮演着重要的角色。; 胡媛夏丽坤; 关键词：IL-21 免疫细胞病毒感染

小鼠B、T淋巴细胞衰减因子真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达: 2010年; 目的构建小鼠B、T淋巴细胞衰减因子(BTLA)的真核表达载体,并分析其在人胚肾HEK293细胞中的表达,为单纯疱疹性角膜基质炎的免疫治疗奠定基础。方法应用PCR法获得小鼠BTLA胞外功能区的cDNA片段,将其插入真核表达载体pcDNA3.1中,获得重组表达质粒pBTLA,经酶切鉴定和测序正确后转染HEK293细胞,并利用间接免疫荧光法、实时定量PCR(real-time PCR)、Western blot技术检测BTLA在细胞中的表达。结果重组质粒pBTLA经酶切鉴定和测序,确认插入序列正确,与基因文库中提供的基因序列同源性达98%～100%。Real-time PCR检测可见转染了重组质粒pBTLA的HEK293细胞内BTLA mRNA表达增强(P=0.00),3个组间HEK293细胞内BTLA mRNA表达差异有统计学意义(F=167.83,P=0.00);Western blot结果显示,转染重组质粒pBTLA的HEK293细胞内BTLA蛋白表达明显增强,转染后24～48 h表达最强。间接免疫荧光结果显示BTLA蛋白主要表达在HEK293细胞的细胞膜和细胞质中。结论成功构建了BTLA的真核表达载体,该重组质粒在HEK293细胞中能够表达BTLA,为后续研究BTLA在抗病毒免疫中的作用奠定基础。; 夏丽坤张胜男陈琳琳周晶; 关键词：真核表达载体基因转染

单纯疱疹性角膜炎发病机制的研究进展被引量：16: 2017年; 单纯疱疹性角膜炎（HSK）是一种全球高发的严重感染性致盲眼病，视力的慢性损害常与感染的复发、角膜瘢痕、角膜白斑、新生血管以及新生淋巴管等相关。根据目前的研究，角膜的损伤是免疫系统对单纯疱疹病毒（HSV）抗原反应的结果。由于HSK发病机制尚不明确，治疗效果不满意，因此全面了解其初次感染、潜伏、复发的机制是有效治疗的前提。本文分别阐述自噬、免疫系统、细胞因子和微小RNA等几个方面在HSK感染与发病中的作用机制，以了解HSK的发生和发展过程，在一定程度上为HSK的诊断提供参考，并为HSK的治疗及药物研制等研究带来新的启发。; 曹楠珏夏丽坤; 关键词：单纯疱疹病毒角膜炎免疫机制

白细胞介素-9在单纯疱疹病毒性角膜基质炎小鼠角膜组织中的表达被引量：1: 2013年; 背景单纯疱疹病毒性角膜基质炎（HSK）是一种由CD4＋T淋巴细胞介导的免疫病理性疾病。国外研究发现，白细胞介素一9（IL一9）在多种免疫性疾病的发病过程中发挥重要作用，但在HSK中是否起作用目前少有报道。目的研究小鼠HSK发生和发展过程中IL一9在角膜组织中的表达，探讨IL一9的表达与HSK进展程度之间的关系。方法4～6周龄清洁级健康BALB／c小鼠180只分为对照组20只和实验组160只。对照组仅进行“#”字形划痕，不接种病毒；实验组小鼠角膜用注射针划痕后接种5μl含有1×10^6空斑单位（PFU）／ml的I型单纯疱疹病毒（HSV-1）KOS毒株建立HSK小鼠模型。分别于病毒接种前（0d），接种后1、3、5、7、8、10、14、21d在裂隙灯显微镜下观察小鼠角膜的变化；于接种后14d制备角膜组织切片，苏木精一伊红染色观察角膜的组织病理学改变；采用荧光实时定量PCR（real-timePCR）法检测IL-9mRNA在小鼠角膜组织中的表达；采用免疫荧光组织化学方法检测IL-9蛋白在小鼠角膜组织中的表达。结果裂隙灯显微镜下观察结果显示，小鼠角膜接种HSV-1后第3天，实验组小鼠出现点状、树枝状、地图状角膜上皮缺损，接种后6d内上皮缺损痊愈，但于接种后第7天起出现角膜基质灰白色混浊，14d基质混浊加重并达高峰，之后逐渐减轻。Real—timePCR结果显示，未接种病毒（0d）的正常小鼠角膜组织中仅有极微量的IL-9mRNA表达，实验组小鼠接种病毒后1、3、5、7、8、10、14dIL-9mRNA在角膜组织中的相对表达量分别为6．37±0．45、5．66±0．53、3．93±0．35、5．62±0．34、3．23±0．18、2．57±0．14、2．19±0．20，总体表达差异有统计学意义（F=92．764，P=0．000），其中接种后各时间点IL-9mRNA相对表达量与0d比较明显增高，差异均有统计学意义（P〈0．05），接种病毒后21d，IL-9mRNA相对表达量与0d比�; 孙超夏丽坤; 关键词：I型单纯疱疹病毒角膜角膜基质炎

IL-17在单纯疱疹性角膜基质炎小鼠中表达的变化被引量：2: 2011年; 目的:研究IL-17在小鼠单纯疱疹性角膜基质炎模型中的表达。方法:将1.0×106空斑单位的单纯疱疹病毒1型KOS毒株接种于BALB/c鼠的角膜上,建立HSK动物模型。免疫组织化学染色观察IL-17在角膜中的表达。分别取正常小鼠及接种病毒后的第1～3,7,10,14,21,28d,用毛细管取小鼠的左眼眼眶静脉窦血1mL,分离淋巴细胞,行荧光抗体染色,用流式细胞仪检测IL-17阳性的CD4+T细胞的表达。在裂隙灯显微镜下观察角膜的变化,检查角膜的组织学病理改变。结果:实验组中,角膜和外周血均有IL-17表达。实验组角膜基质内炎性细胞、角膜混浊程度非常严重。IL-17的表达与HSK小鼠炎症表现的严重程度成正相关(r=0.609,P<0.01)。结论:IL-17在HSK小鼠模型中呈高表达,且IL-17在HSK的发病过程中起一定作用。; 张胜男孙超胡媛夏丽坤; 关键词：IL-17 角膜炎疱疹性

可溶性B、T淋巴细胞衰减因子及其配体在单纯疱疹性角膜基质炎小鼠体内的异常表达被引量：1: 2011年; 目的研究B、T淋巴细胞衰减因子(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)及其配体疱疹病毒侵入介体(herpes virus entry mediator,HVEM)在单纯疱疹性角膜基质炎(herpetic stromal keratitis,HSK)小鼠角膜组织中及外周血CD4+T细胞上的表达水平,探讨共抑制信号BTLA-HVEM是否参与了CD4+T细胞介导的HSK免疫病理反应。方法将106PFU的单纯疱疹病毒I型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)KOS毒株接种于BALB/c鼠的角膜上建立HSK动物模型,分别于角膜接种病毒前(0d),接种病毒后的第3、7、10、14、21天,用毛细管取小鼠的左眼眼眶静脉窦血1mL,分离淋巴细胞,行荧光抗体染色,用流式细胞仪检测CD3+CD4+BTLA+T细胞和CD3+CD4+HVEM+T细胞阳性率;在裂隙灯显微镜下观察小鼠角膜变化;免疫组织化学方法检测BTLA蛋白及HVEM蛋白在角膜组织中的表达。结果 BALB/c鼠的角膜接种HSV-1后的1～5d,角膜擦拭液中均检测出HSV-1复制,表明小鼠感染了单纯疱疹病毒。裂隙灯显微镜观察显示:角膜接种HSV-1后第3天,所有小鼠均患了急性上皮性角膜炎,并于感染后1周内痊愈,自病毒接种后第8天起,小鼠出现角膜基质炎的改变,表现为角膜基质呈灰白色混浊,角膜基质混浊于病毒接种后的第10天达到高峰,持续至第14天后逐渐减轻。流式细胞仪检测显示,小鼠外周血淋巴细胞中CD3+CD4+BTLA+T细胞和CD3+CD4+HVEM+T细胞的阳性率,在角膜接种病毒前(0d)分别为(3.15±0.60)%和(9.84±1.06)%,在角膜接种病毒后第10天(HSK疾病程度最严重时)分别增加到(20.47±3.15)%和(45.18±3.90)%(与0d相比差异均有显著统计学意义,均为P<0.01)。免疫组织化学方法检查HSK小鼠角膜组织中BTLA和HVEM的蛋白表达结果一致:HSK临床表现最严重时,即病毒接种后第10天时,BTLA蛋白和HVEM蛋白在角膜组织中表达最强,主要表达于角膜基质层内浸润的炎性细胞上,角膜上皮层和内皮层也有表达。结论在HSK小鼠模型中,BTLA及其配�; 夏丽坤李琰张胜男曹哲瑶陆岩杨宏伟; 关键词：B淋巴细胞 T淋巴细胞

T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3对单纯疱疹性角膜基质炎的免疫调节作用被引量：5: 2009年; 目的研究T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(T cell immunoglobulin and mucin-do-main-containing molecule-3,Tim-3)在小鼠单纯疱疹性角膜基质炎(herpetic stromal keratitis,HSK)发病机制中的免疫调节作用。方法将1.0×106空斑单位的单纯疱疹病毒1型KOS毒株接种于BALB/c鼠的角膜上,建立HSK动物模型;在角膜接种病毒的同时将抗Tim-3单克隆抗体100μg注射到aTim-3组小鼠的腹膜腔内作为aTim-3组;ISO对照组和NS对照组小鼠腹膜腔内注射非特异性免疫球蛋白同型对照抗体ISO100μg或等容积的生理盐水。在裂隙灯显微镜下观察角膜的变化,检查角膜的组织学病理改变,用VERO细胞检测角膜病毒滴度,并行小鼠迟发型超敏反应(delayedtypehypersensitivity,DTH)检测和脾细胞体外分泌细胞因子的检测。结果腹膜腔内注射抗Tim-3单克隆抗体的小鼠,角膜基质内炎性细胞较对照组小鼠明显增多、角膜混浊程度也较对照组小鼠明显严重(P均<0.01)、DTH值(1.025±0.088)mm明显强于ISO对照组和NS对照组[DTH值分别为(0.651±0.051)mm和(0.642±0.064)mm],差异均具有显著统计学意义(P均<0.01);同时,腹膜腔内注射了抗Tim-3单克隆抗体的小鼠,脾细胞分泌Th1型细胞因子IFN-γ的量(25.36±3.65)μg.L-1明显多于ISO对照组和NS对照组[分别为(19.23±1.82)μg.L-1和(18.73±0.98)μg.L-1],差异均具有显著统计学意义(P均<0.01);但腹膜腔内注射抗Tim-3单克隆抗体未影响小鼠角膜内病毒复制及小鼠HSK发病率和小鼠死亡率。结论Tim-3作为一个免疫调节分子,通过抑制Th1型免疫反应,调节HSK的疾病程度。; 夏丽坤李琰张胜男周佳子; 关键词：单纯疱疹病毒角膜基质炎角膜 TH1细胞

小鼠角膜组织石蜡切片制作方法的探讨被引量：4: 2011年; 目的探讨一种效果较好的小鼠角膜石蜡切片制作方法。方法取30只BALB/C小鼠取出眼球后,A组20只眼球,用固定液1(体积分数10%中性甲醛10mL、体积分数95%乙醇85mL、冰醋酸5mL混合)固定;B组20只眼球,用固定液2(多聚甲醛4g,加入0.1mol.L-1磷酸缓冲液80mL,加热至60℃左右,持续搅拌,使粉末完全溶解,加少许1mol.L-1NaOH澄清。待冷却后,加冰醋酸5mL、丙酮10mL,用0.1mol.L-1磷酸缓冲液补足至100mL)固定;C组20只眼球,用固定液3(无水乙醇60mL、体积分数10%中性甲醛10mL、冰醋酸10mL、氯仿20mL混匀)固定。所有眼球标本固定2h后,显微镜下去除巩膜、虹膜、晶状体,完整保留角膜。固定24h后,分别做HE染色和免疫组织化学染色,显微镜下观察其差异。结果大体观察:A组部分角膜皱缩变形;B组、C组角膜外形均无明显变化,无皱缩和凹陷变形,能保持原有的形态。HE染色示A组标本染色鲜明,角膜各层结构清楚,但是角膜基质层出现明显脱水现象;B组标本未见明显脱水现象,但角膜结构过度压缩,出现明显的脱片现象;C组标本可观察到角膜各层组织结构完整,无明显结构改变,未见脱片及基质层脱水现象,角膜各层组织结构清晰无裂隙。免疫组织化学染色3组均显示HVEM阳性,但C组标本染色效果优于A组、B组,且脱片程度低,固定液3适用于角膜组织的固定。结论固定液3固定角膜组织,效果优于其他两种固定液。; 张胜男夏丽坤胡媛; 关键词：小鼠角膜石蜡切片

单纯疱疹性角膜炎免疫调节因子IL-12A与microRNA-21靶向作用关系的实验研究被引量：1: 2016年; 目的寻找一种可同时调控白细胞介素-12A(IL-12A)等多个单纯疱疹性角膜炎(HSK)免疫调节因子的microRNA(miRNA)。鉴定miRNA与IL-12A等免疫调节因子的靶向调控作用并预测其在HSK中可能的作用机制。方法选取293T人胚肾细胞等培养材料进行实验。实验主要包括运用Target Scan v7.1、miRanda v2010、miRBase v2014及miRTar Base v6.0数据库进行多个免疫调节因子的miRNA预测,寻找共同的miRNA;运用miRBase数据库对各物种miR-21序列进行对比;通过RGator v3.0数据库分析hsa-miR-21在各组织中的表达情况;通过数据库检索,找出尚未验证的hsa-miR-21候选靶基因进行结合位点验证;通过构建IL-12A的3'-非翻译区(UTR)野生型及突变型载体质粒,将相应的质粒与hsa-miR-21模拟物转染到293T细胞中;通过双荧光素酶报告系统检测萤光素酶活性,初步验证两者的靶向结合作用;运用以上数据库进行hsa-miR-21的候选靶基因预测,得出候选靶基因集合;对候选靶基因集合进行基因功能富集分析和信号转导通路富集分析,并预测hsa-miR-21在HSK中可能的作用机制。结果通过以上数据库检索,发现hsa-miR-21是可以同时调控以上多个HSK免疫调节因子的miRNA,且各物种miR-21的序列基本一致。研究发现IL-12A是尚未验证的候选靶基因。双荧光素酶报告系统分析表明hsa-miR-21能够靶向作用于IL-12A的3'-UTR(t=-24.43,P<0.05),初步证明两者有靶向结合作用。结合数据库筛选出hsa-miR-21的候选靶基因共609个,其基因功能主要富集于调节细胞、细胞蛋白质代谢等过程(P<0.05),并涉及到丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路、单纯疱疹感染通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、NF-κB信号通路及多种癌症通路(P<0.05)。研究结果表明,hsa-miR-21可能通过MAPK信号转导通路中的27个靶基因、单纯疱疹感染通路中的19个靶基因、TNF信号通路中的15个靶基因及NF-κB信号通路中的10个靶�; 曹楠珏夏丽坤强薇张小娟张帆刘鹤南; 关键词：MICRORNA-21 单纯疱疹性角膜炎生物信息学

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国家自然科学基金(30772394)

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