国家自然科学基金(30772363) 作品数:21 被引量:142 H指数:8 相关作者: 余加林 刘官信 林丽华 李芳 林雅茵 更多>> 相关机构: 重庆医科大学 成都军区总医院 第三军医大学西南医院 更多>> 发文基金: 国家自然科学基金 重庆市自然科学基金 国家教育部博士点基金 更多>> 相关领域: 医药卫生 生物学 更多>>
铜绿假单胞菌3-氧十二烷酰高丝氨酸内酯信号分子对单核细胞Toll样受体2和4的影响 2009年 目的研究铜绿假单胞菌群体感应系统信号分子3-氧十二烷酰高丝氨酸内酯(3-O-C12-HSL)对人外周血单核细胞凋亡以及TLR2/4 mRNA表达的影响。方法自健康献血者血液中分离单核细胞进行体外培养,并以0、1、10、50和100μmol/L 3-O-C12-HSL作用,采用MTT法,观察不同浓度的3-O-C12-HSL分别作用对人单核细胞生长增殖的影响。用RT-PCR测定单核细胞TLR2/4 mRNA表达。结果3-O-C12-HSL刺激单核细胞12 h后TLR2/4 mRNA表达降低,且呈剂量依赖关系,TLR2/4 mRNA在100μmol/L时最为显著(0.3494±0.0979,0.3351±0.1121)。3-O-C12-HSL对单核细胞增殖有抑制作用,呈剂量依赖关系,差异有显著性(P≤0.05)。结论3-O-C12-HSL可以激发单核细胞细胞凋亡,下调Toll样受体的表达水平,从而削弱单核细胞对铜绿假单胞菌的应答能力,这可能是铜绿假单胞菌逃逸免疫清除的重要原因之一。 芦起 余加林 林丽华 冉桃 邓兵 李亚莎 杨锡强关键词:铜绿假单胞菌 单核细胞 依地酸与3种抗菌药联合对黏液型铜绿假单胞菌生物膜的作用 被引量:3 2009年 目的研究金属离子螯合剂依地酸(EDTA)联合3种抗菌药对黏液型铜绿假单胞菌生物膜的清除效应。方法平板法培养铜绿假单胞菌生物膜,微量肉汤稀释法测量环丙沙星、庆大霉素、氨苄西林单独及与EDTA联合对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(MIC)。荧光探针FITC-ConA染生物膜细菌胞外多糖、荧光显微镜下观察EDTA作用前后生物膜多糖差别,荧光探针SYTO9/PI标记生物膜内细菌、激光共聚焦显微镜(CLSM)观察药物作用前后生物膜的结构变化。生物膜中单独或联合加入抗菌药与EDTA后,超声清洗,琼脂板计数生物膜内菌量。结果0.5mg/ml EDTA与抗菌药联合可使环丙沙星和氨苄西林的MIC降低至原值的1/30、庆大霉素的MIC降低至原值的1/2。30mg/ml EDTA作用后生物膜多糖减少、生物膜厚度降低、死菌比例增加、菌落稀疏,且与3种抗菌药联合对铜绿假单胞菌生物膜有显著的协同杀菌效应,使其中菌落数约由107降至103CFU/ml,P<0.05。结论EDTA与3种抗菌药联合对浮游状态下的铜绿假单胞菌均有协同杀菌效应。EDTA可以破坏铜绿假单胞菌生物膜结构,与3种抗菌药联合对生物膜均有显著的清除作用。 林雅茵 余加林 林丽华 刘官信关键词:铜绿假单胞菌 生物膜 依地酸 巯乙磺酸钠联合环丙沙星对铜绿假单胞菌生物膜的作用 2012年 目的:探讨巯乙磺酸钠(mesna)对成熟铜绿假单胞菌生物膜(BF)的影响及其联合环丙沙星(CIP)对铜绿假单胞菌BF的作用。方法:微量稀释法检测mesna和CIP对铜绿假单胞菌PAO1的最低抑菌浓度(MIC);建立铜绿假单胞菌BF体外模型后分为对照组、低浓度mesna组及高浓度mesna组,用激光共聚焦显微镜(CLSM)采集并结合BF图像结构分析软件(ISA)定量分析mesna对铜绿假单胞菌BF作用后的结构参数;铜绿假单胞菌BF再次分为mesna组、CIP组及CIP联合mesna组,用CLSM采集BF图像并结合Amira 5.2三维重建软件定性分析mesna单独及联合CIP对成熟铜绿假单胞菌BF的作用;以棋盘设计,将不同浓度的mesna(0、0.5、1.0、2.0、4.0g.L-1)和不同浓度的CIP(浓度依次为(0、1/2、1、2、4和8MIC)两两组合,平板计数法检测mesna单独及与CIP联用后BF内活菌数。结果:mesna对PAO1的MIC为10g.L-1,CIP对PAO1的MIC为0.125mg.L-1;CLSM图像经ISA软件定量分析显示,与对照组比较,mesna能使BF厚度、平均扩散距离和结构熵均减少(P<0.01),区域孔率增加(P<0.01),高浓度组较低浓度组效应更明显(P<0.01);CLSM图像经三维重建后可见,单用mesna(2g.L-1),BF内细菌密集层叠,厚度较厚,可见大量活菌,未见明显死菌;单用CIP(2MIC),BF内仍可见大量活菌,死菌数少;mesna(2g.L-1)联合CIP(2 MIC)组可见BF细菌稀疏、厚度薄,活菌数少,BF内可见大量死菌;单用2g.L-1 mesna能使BF中的活菌数减少(P<0.05),单用2MICCIP可使BF中活菌数降低(P<0.05),1g.L-1 mesna与1 MIC的CIP联合应用可使BF上的活菌数明显减少(P<0.05)。结论:mesna能破坏铜绿假单胞菌BF形态结构,mesna与CIP存在协同作用,可增强其杀菌能力。 陈盛 余加林 罗则佳 何念海 孙凤军关键词:铜绿假单胞菌 生物膜 环丙沙星 巯乙磺酸钠对家兔留置导尿管表面大肠杆菌生物膜的作用 被引量:1 2012年 目的构建留置导尿管表面大肠杆菌生物膜(biofilm,BF)体内模型,研究巯乙磺酸钠对体内留置导尿管表面大肠杆菌BF的作用。方法家兔行导尿术,经导尿管注入大肠杆菌4 d,扫描电镜及平板计数法检测留置导尿管表面大肠杆菌BF动物模型构建;经导尿管灌注巯乙磺酸钠,扫描电镜观察巯乙磺酸钠对导尿管表面大肠杆菌BF的作用,平板计数法检测巯乙磺酸钠对导尿管表面细菌数的影响。结果模型组可见大量细菌在导尿管上呈团状或膜状黏附生长,厚薄不均的黏液状物质连接成一大片,平均菌落计数模型组(4.76±0.29)较对照组(2.49±0.22)明显增多(t=17.44,P<0.01);巯乙磺酸钠干预后,巯乙磺酸钠能减少留置导尿管表面大肠杆菌BF中基质样物质,仅见散在的细菌黏附于管壁上,有少数细菌的散在团状聚集;平均菌落计数与空白对照组(5.77±0.26)及生理盐水对照组(5.54±0.52)比较,巯乙磺酸钠组(2.85±0.36)能使BF中的细菌数明显减少(F=136.44,P<0.01)。结论留置导尿管表面大肠杆菌BF动物模型成功建立;巯乙磺酸钠对体内留置导尿管表面大肠杆菌BF有破坏作用。 陈盛 余加林 罗则佳 何念海 孙凤军关键词:大肠杆菌 生物膜 留置导尿管 氨溴索对铜绿假单胞菌生物膜密度感应系统信号分子及相关基因的影响 被引量:5 2009年 目的探讨氨溴索对铜绿假单胞菌生物膜(biofilm,BF)密度感应(quorum-sensing,QS)系统信号分子酰化高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserinelactone,AHL)以及AHL合成酶编码基因表达的影响。方法通过平板培养法培养铜绿假单胞菌建立成熟的体外BF模型,用扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)鉴定生物膜的形成情况。不同浓度氨溴索干预后,应用实时荧光定量PCR(real-time PCR)和AHL感应菌株根癌土壤杆菌(WCF47)分别检测其对铜绿假单胞菌AHL合成酶编码基因rhlI和lasI mRNA及AHL表达的影响。结果通过实时荧光定量PCR检测,结果显示氨溴索3.75mg/ml作用组基因lasI和rhlI与对照组相比表达量均显著减少(P<0.05)。氨溴索1.875mg/ml干预后,有同样趋势,但效应不如高浓度明显(P<0.05)。氨溴索3.75mg/ml作用后AHL的表达量较对照组明显减少(P<0.05),氨溴索1.875mg/ml作用后亦有减少(P<0.05)。结论氨溴索可以通过下调信号分子AHL合成酶编码基因以及AHL的表达来抑制BF。 孙小敏 余加林 林丽华 林雅茵 邹志慧关键词:氨溴索 铜绿假单胞菌 密度感应系统 信号分子 红霉素、氨溴索与环丙沙星雾化吸入对实验大鼠铜绿假单胞菌生物膜的影响 被引量:2 2009年 目的研究红霉素和氨溴索分别联合环丙沙星雾化吸入对铜绿假单胞菌成熟生物膜的干预效果。方法平板法培养成熟铜绿假单胞菌生物膜;微量肉汤稀释法测量红霉素和环丙沙星的最低抑菌浓度;制作气管插管铜绿假单胞菌生物膜感染模型;平板计数法计算红霉素、氨溴索分别联合环丙沙星对生物膜菌落数的影响;日本岛津紫外-可见光分光光度计UV1700测铜绿假单胞菌菌液的A值;石蜡切片HE染色定性观察肺组织的炎症情况;扫描电镜定性观察各处理组的生物膜结构变化。结果各处理组干预7 d后肺组织细菌菌落计数(×104CFU/m l):干预组分为:生理盐水对照,氨溴索,红霉素,红霉素联合环丙沙星,氨溴索联合环丙沙星,各组分别为139.250±42.0162、101.625±40.4190、109.625±33.4747、57.750±37.8295和22.250±17.3184,前3组与后2组对比差异均有显著性(P<0.05),前3组之间对比差异没有显著性(P>0.05),后2组对比差异有显著性(P<0.05)。导管生物膜细菌菌落计数(×104CFU/m l):5组分别为170.000±48.3263、127.625±39.0163、133.500±33.6876、70.375±35.7768和38.125±19.1045,结论和肺组织菌落计数是一致的。导管生物膜电镜观察:第1组导管内表面均有较厚基质覆盖,2、3组减少不明显,而联合用药组导管内表面生物膜明显减少,其中第5组效果更好。结论氨溴索与红霉素分别联合环丙沙星雾化吸入在控制导管生物膜和呼吸系统相关感染均具有显著效果,其中氨溴索联合环丙沙星疗效更好。 冉桃 余加林 刘官信 芦起氨溴索对铜绿假单胞菌生物被膜密度感应系统毒力因子及相关基因的影响 被引量:2 2009年 目的:探讨氨溴索对铜绿假单胞菌生物被膜(BF)密度感应(QS)系统所调控的毒力因子编码基因以及各自对应毒力因子表达的影响.方法:通过平板培养法培养铜绿假单胞菌建立成熟的BF体外模型.采用不同浓度氨溴索干预后,应用实时荧光定量PCR(rRT-PCR)检测其对QS系统各毒力因子编码基因表达的影响;采用ELISA法检测外毒素A和弹性蛋白酶水平;采用地衣酚—硫酸法检测鼠李糖脂水平;采用Folin—酚比色法检测碱性蛋白酶活性.结果:经氨溴索3.750g/L作用后基因toxA,rhlA,lasB,aprAmRNA相对于培养基对照组的表达量均显著减少,由1.000分别变化为(3.03±0.08),(2.70±0.09),(2.10±0.10),(2.20±0.10)(P<0.05).同时毒力因子外毒素A、弹性蛋白酶、鼠李糖脂、碱性蛋白酶的表达量也较培养基对照组明显减少,分别由(15220.16±988.89),(81.38±5.44),(289.73±6.72),(5011±108.78)减少至(3481.59±599.64),(29.76±3.84),(101.74±3.32),(1757±57.21)(P<0.05).经氨溴索1.875g/L干预后具有同样趋势,但效应不如高浓度明显(P<0.05).结论:氨溴索可以降低BFQS系统调控的毒力因子编码基因以及各自对应的毒力因子的表达. 孙小敏 余加林 林丽华 林雅茵 李娅莎关键词:氨溴索 铜绿假单胞菌 生物被膜 密度感应系统 毒力因子 氨溴索对铜绿假单胞菌生物膜早期黏附及胞外多糖的影响 被引量:3 2008年 目的研究氨溴索对铜绿假单胞菌PA01菌株BF早期黏附及胞外多糖复合物(Extracellular Polymer-ic Substances,EPS)的影响。方法利用荧光多功能酶标仪检测各组不同时间点96孔板中pGFPuv转化PA01菌株的荧光强度,计算黏附率以表示干预对不同时间点细菌黏附的影响;利用罗丹明标记的麦胚凝集素(WGA)特异性结合细菌EPS,荧光显微镜下定性观察各组EPS的变化;利用硫酸-苯酚法定量各组细菌EPS的产量。结果8 h组,氨溴索高浓度干预后细菌的黏附率由0.72±0.17下降至0.49±0.08,t=4.03,P<0.05,与克拉霉素阳性对照组黏附率(0.50±0.06)相比,t=-1.19,P>0.05;氨溴索低浓度干预后黏附率也有下降,但不及高浓度组明显;其余时间组趋势与8 h组大致相似。罗丹明标记WGA可使胞外多糖显色,在荧光显微镜下观察可见氨溴索干预后EPS减少,稀薄;EPS定量实验,EPS总量(μg)/细菌干重(g)氨溴索干预组(477.82±7.90)较生理盐水对照组(523.76±10.12)有明显降低,t=8.76,P<0.05。结论氨溴索可显著减少PA01菌株黏附及产EPS的能力。 杨华 余加林 刘官信 李禄全关键词:铜绿假单胞菌 生物膜 氨溴索 大蒜素对铜绿假单胞菌生物膜早期黏附及胞外多糖的影响 被引量:15 2009年 目的研究大蒜素对铜绿假单胞菌PA01菌株生物膜(biofilm,BF)早期黏附及胞外多糖复合物(Ex-tracellular Polymeric Substances,EPS)的影响。方法利用荧光多功能酶标仪检测各组不同时间点96孔板中pGF-Puv转化PA01菌株的荧光强度,计算黏附率以表示干预对不同时间点细菌黏附的影响,利用荧光显微镜下定性观察细菌的黏附量;应用异硫氰酸标记的刀豆蛋白A(FITC conjugated concanavalin A,FITC-conA)特异性结合细菌EPS,荧光显微镜下定性观察各组EPS的变化;利用硫酸-苯酚法定量各组细菌EPS的产量。结果6h组,大蒜素高浓度干预后细菌的黏附率由0.70±0.03下降至0.50±0.01,t=15.014,P<0.05,大蒜素低浓度干预后黏附率也有下降,但不及高浓度组明显;除了9h组其他时间组趋势与6h组大致相似,可能与大蒜素含量下降有关。荧光显微镜观察可见生理盐水对照组细菌菌落分布,干预组黏附的细菌稀疏散在分布,以高浓度为甚。FITC-conA可使胞外多糖显色,在荧光显微镜下观察可见大蒜素干预后EPS减少,稀薄;EPS定量实验,EPS总量大蒜素高浓度干预组(181.19±1.59)μg较生理盐水对照组(602.66±21.94)μg有明显降低,t=60.589,P<0.05。结论大蒜素可显著减少PA01菌株黏附及产EPS的能力。 林丽华 余加林 林雅茵 刘官信关键词:大蒜素 铜绿假单胞菌生物膜 胞外多糖 SYTO9/PI荧光探针标记的铜绿假单胞菌PAO1菌株生物被膜形成的动态观察 被引量:13 2008年 目的探讨铜绿假单胞菌细菌生物被膜(biofilm,BF)形成发展过程中空间立体结构变化。方法SYTO9/PI荧光探针标记PAO1菌株,体外建立6h、1d、3d及6d时间组铜绿假单胞菌PAO1菌株BF模型,激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)摄取BF形成发展各阶段不同层面的图片堆,经图像结构分析软件(imagestructureanaly-zer,ISA)分析获得PAO1菌株BF相关空间结构参数定量化数据。结果①CLSM结合SYTO9/PI荧光探针标记,实现了对PAO1菌株BF动态形成过程的观察。②随着BF形成时间的延长,各层死菌比例逐渐增加,且死菌多分布于微菌落中心。③ISA软件定量化分析显示,随着BF发展,厚度显著增加,前3d增加程度显著大于后3d;区域孔率显著下降趋势;平均扩散距离呈逐渐增加趋势;结构熵呈显著上升趋势。结论利用ISA程序结合SYTO9/PI荧光探针可以表征PAO1菌株BF的空间结构特征和BF各层细菌的生存状态。 陈波曼 余加林 刘官信 胡琳燕 李芳 杨华关键词:生物被膜 铜绿假单胞菌