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人caspase-1真核表达载体的构建及表达: 2009年; 目的构建人caspase-1真核表达载体,观察其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法分离人外周血淋巴细胞,LPS刺激提取细胞总RNA,RT-PCR方法分别扩增caspase-1两片段S_1、S_2,利用重叠延伸PCR方法(SOE)获得caspase-1全长序列,将其克隆入pIRES_2-EGFP载体,进行茵落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定。通过jetPEI方法转染HepG2肝癌细胞,倒置相差荧光显微镜下观察其表达情况,RT-PCR分析caspase-1的表达水平。结果从外周淋巴细胞中经RT-PCR分别扩增出365bp和883bp片段,纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到一1234bp的条带,与预期序列长度一致。SOE产物与pIRES_2-EGFP经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后连接,茵落PCR鉴定获得数个阳性克隆,质粒经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ限制性酶谱分析酶解出1234bp条带,DNA序列分析证实重组载体中的DNA序列与GeneBank中人caspase-1序列完全一致。将该载体转染至HepG2细胞中,经RT-PCR证实,与转染pIRES_2-EGFP空载体的对照组细胞相比,caspase-1水平明显升高。结论本研究成功构建人caspase-1表达载体pIRES_2-EGFP-caspase-1,该载体能够在人肝癌细胞中高效表达外源基因。; 李青春张素华马晓君肖伟玲梁淑娟; 关键词：肝肿瘤真核表达载体 CASPASE-1

小鼠分泌型IL-1β真核表达载体的构建及其表达: 2011年; 目的:构建小鼠经典分泌途径IL-1β真核表达载体,转染至Hepa1-6细胞,并测定其分泌表达水平。方法:引物延伸获得小鼠AFP信号肽序列(sAFP),RT-PCR扩增获得小鼠IL-1β成熟蛋白基因序列(mIL-1β),SOE方法将两段序列拼接形成融合基因,与pIRES2-EGFP质粒重组构建分泌型真核表达载体pIRES2-EGFP-smIL-1β,并将其转染至Hepa1-6细胞,RT-PCR检测融合基因的表达水平,Western blot检测细胞内mIL-1β蛋白的表达,ELISA法测定培养上清及细胞裂解液中mIL-1β水平。结果:经SOE法拼接获得的融合基因与GenBank中登录的序列一致,RT-PCR检测显示该载体能够在Hepa1-6细胞中表达融合基因mRNA,细胞培养上清中mIL-1β的分泌水平明显上升,而胞质中的mIL-1β无明显变化。结论:成功地构建了经典途径分泌的mIL-1β重组表达载体,该载体可以在Hepa1-6细胞培养上清中有效分泌具有生物活性的mIL-1β。; 肖伟玲王雪净牟东珍林志娟王焕芹梁淑娟; 关键词：信号肽分泌表达

siRNA阻断NF-κB通路抑制HepG2细胞增殖及NK杀伤抵抗性: 2009年; 目的利用小干扰RNA(siRNA)阻断肝癌细胞HepG2中的NF-κB信号通路,研究其对肝癌细胞增殖活性及NK杀伤敏感性的影响。方法利用NF-κB p65 siRNA转染HepG2细胞,48h后分别进行Western blotting及ELISA检测NF-κB p65蛋白的表达;MTT法检测转染后细胞的增殖变化及对NK-92细胞杀伤敏感性的变化。结果转染NF-κB p65 siRNA后肝癌细胞中NF-κB p65蛋白表达的水平明显下降;MTT检测发现,与对照组相比,NF-κB p65 siRNA能够明显抑制HepG2细胞的增殖活性,同时使其对NK-92细胞介导的杀伤敏感性增加(P<0.05)。结论siRNA阻断NF-κB通路能够抑制肝癌细胞增殖及对NK细胞杀伤的抵抗性。; 刘艳艳孙萍梁淑娟; 关键词：SIRNA NF-ΚB 增殖

宿主因素在干扰素-α耐药中的作用及机制的研究进展: 2009年; 摘要干扰素-α（IFN-α）具有广谱的抗病毒、抗肿瘤及免疫调节作用，是临床上治疗病毒性疾病及肿瘤的首选药物，但仍有相当一部分患者未能达到满意的疗效，存在不同程度的耐药现象，严重制约了人类的生活质量。近年来，IFN—α耐药机制及其耐药机制的逆转成为国内外研究的热点之一，研究表明，宿主因素在IFN—α耐药机制中可能发挥了重要的作用，影响着IFN—α的临床疗效。; 王焕芹梁淑娟; 关键词：IFN-Α 耐药宿主因素

IL-1β对Hepa1-6细胞增殖、迁移及IFN应答的影响被引量：1: 2011年; 目的:构建应用于小鼠肝脏内表达和研究的IL-1β肝癌细胞特异性表达载体,观察其对小鼠Hepa1-6细胞体外增殖活性、迁移能力及干扰素增殖抑制效应等体外生物学行为的影响。方法:由C57BL/6小鼠腹腔液巨噬细胞扩增IL-1β基因,构建肝脏特异性pLIVE-IL-1β重组表达载体。利用transIT-LT1将鉴定后的pLIVE-IL-1β转染至Hepa1-6肝癌细胞,RT-PCR及双抗体夹心ELISA法分析转染前后IL-1表达水平,MTT法分析IL-1对细胞体外增殖活性的影响;利用细胞划痕实验分析对其迁移能力的影响,并确定对IFN-α诱导的细胞增殖抑制效应的作用。结果:重组载体经限制性酶谱分析酶解出822bp的条带,其序列与GenBank登录的小鼠IL-1β基因一致;转染后的Hepa1-6细胞培养上清中IL-1β的表达明显增高,细胞体外增殖速度明显加快;给予IFN-α作用后,IL-1β的表达使细胞对干扰素的抵抗性明显增强。结论:小鼠IL-1β肝癌组织特异性表达载体pLIVE-IL-1β能够在小鼠肝癌细胞中高效表达IL-1β,并能够显著促进肿瘤的体外增殖和迁移能力,削弱IFN-α对Hepa1-6细胞的增殖抑制作用。; 林志娟梁淑娟王焕芹李艳平肖伟玲; 关键词：IL-1Β 肝癌 NK细胞促炎性细胞因子干扰素

Critical role of Toll-like receptor signaling in NK cell activation: 2012年; Toll-like receptors (TLRs) and NK cell receptors are the most important receptor superfamilies in innate immunity. TLRs act as the sensor of external pathogens, while NK cells detect alterations in endogenous protein expression on target cells through activating and inhibitory receptors. Accumulating data has demonstrated that TLRs and NK cell receptors can coordinate and regulate each other during immune responses, which contributes to the initiation of innate response and the priming of adaptive responses. TLRs can activate NK cell function directly or with the help of accessory cells in a cytokine or cell-to-cell contact dependent manner. More understanding of the recognition of innate receptors and interactions between them may provide important insights into the design of effective strategies to combat tumor and microbial infections. In this review, we summarize how TLRs and NK cells discriminate the self or non-self components respectively. And importantly, we pay more attention to the role of TLR sig-naling in induction of NK cell activation, responses and the crosstalk between them.; GUO QieZHANG Cai; 关键词：TOLL样受体 NK细胞细胞受体微生物感染

小鼠IL-1β在H22细胞的表达及对NK细胞杀伤活性的影响被引量：5: 2007年; 目的:重组表达小鼠IL-1β全长基因,转染H22肝癌细胞,分析对NK细胞杀伤活性的影响。方法:构建小鼠IL-1β重组表达载体pIRES2-EGFP-mIL-1β,利用jetPEI转染H22肝癌细胞,RT-PCR和激光扫描共聚焦显微镜分析IL-1β重组载体的表达,MTT方法分析转染前后,野生型小鼠脾脏NK细胞对H22细胞杀伤活性的变化。结果:RT-PCR扩增出小鼠IL-1β,长度约843bp。纯化的PCR产物与pIRES2-EG-FP同时经XhoI和EcoRI双酶切,在T4连接酶作用下连接,转化大肠杆菌,提取质粒经PCR、限制性酶谱分析(XhoI+EcoRI)和DNA序列测定后,确认获得重组表达载体pIRES2-EGFP-mIL-1β。将该质粒转染至H22小鼠肝癌细胞中,RT-PCR和荧光观察证实,H22细胞能表达高水平IL-1β重组表达载体,与转染空载体的对照组细胞相比,IL-1β转基因后H22细胞对NK92细胞杀伤抵抗性明显增强,同时野生型小鼠脾脏NK细胞对pIRES2-EGFP-mIL-1β转基因细胞的杀伤活性明显下降,效靶比40:1时下降了约10%。结论:IL-1β能够明显增强H22肝癌细胞对NK细胞杀伤的抵抗性,可能是肝癌细胞借以逃逸天然免疫应答的重要机制。; 肖伟玲梁淑娟牟东珍王雪净吴慧娜; 关键词：IL-1Β NK细胞天然免疫肝癌

分泌型人IL-1β表达载体的构建及在H7402细胞中的表达: 2008年; 目的构建经典途径分泌型人白细胞介素1β(shIL-1β)重组表达载体,检测其在H7402肝癌细胞中的表达。方法采用SOE方法将人红细胞生成素(EPO)信号肽序列和编码人白细胞介素(hIL-1β)成熟蛋白的基因序列拼接形成融合基因,与pIRES2-EGFP质粒重组构建shIL-1β真核表达载体pIRES2-EGFP-shIL-1β,利用jetPEI方法将其稳定转染H7402细胞(H7402/shIL-1β),荧光显微镜及RT-PCR检测融合基因的表达水平,间接ELISA方法测定培养上清hIL-1β分泌水平。结果荧光显微镜下观察可见H7402/shIL-1β细胞发出明亮绿色荧光,RT-PCR检测显示pIRES2-EGFP-shIL-1β能够在H7402细胞中稳定表达融合基因mRNA,同时细胞培养上清中hIL-1β表达水平明显上升。结论成功构建了经典途径分泌的hIL-1β重组表达载体,该载体可在H7402细胞中稳定分泌生物活性的hIL-1β。; 肖伟玲林亚杰牟东珍孙萍梁淑娟; 关键词：分泌表达肝癌细胞信号肽

白细胞介素-1在肿瘤靶向治疗策略中的价值: 2009年; 白细胞介素-1(IL-1)家族成员是一类重要的促炎性细胞因子,近年研究证实,该家族的因子不仅是体内免疫调节和炎症反应的核心介质,而且在许多肿瘤形成和进展中起着重要作用,以IL-1为靶向针对其合成及信号转导途径各层次的治疗策略,如ICE抑制剂、NF-κB抑制剂、IL-1Ra等均显示了在肿瘤治疗中的价值。; 刘艳艳梁淑娟; 关键词：白细胞介素1 肿瘤靶向治疗

肝癌细胞特异性IL-1β反义RNA对小鼠移植肝癌的抑制被引量：5: 2009年; 目的:构建肝癌细胞特异性小鼠IL-1β反义RNA表达载体,观察其对H22肝癌细胞小鼠移植瘤生长的影响及其相关机制。方法:构建由AFP最小启动子和CMV增强子嵌合序列调控的携IL-1β反义RNA表达载体pafpIRES2-antiIL-1β1和pafpIRES2-antiIL-1β2,经质粒PCR、限制性酶谱分析、序列测定进行鉴定。反义RNA表达载体转染小鼠H22肝癌细胞,分H22/mock组、H22/antiIL-1β1组、H22/antiIL-1β2三组,RT-PCR检测IL-1β的表达水平。以转染后的H22细胞皮下接种建立荷肝癌小鼠模型,观察移植瘤体积和重量,MTT法检测荷瘤小鼠脾脏中分离的NK细胞对H22细胞的杀伤活性。结果:经质粒PCR、限制性酶谱分析、序列测定证实成功构建能够在肝癌细胞中特异性表达IL-1β反义RNA的表达载体pafpIRES2-anti-IL-1β1和pafpIRES2-antiIL-1β2,转染H22细胞后细胞中IL-1β表达水平明显下降,以pafpIRES2-antiIL-1β2更为显著。成功建立荷肝癌小鼠模型,与H22/mock组小鼠相比,H22/antiIL-1β2组小鼠移植瘤体积较小,生长显著减慢(P<0.05)。H22/anti-IL-1β1、H22/antiIL-1β2组荷瘤小鼠的NK细胞对H22细胞的杀伤活性明显增强(P<0.05或P<0.01)。结论:成功构建的肝癌细胞特异性IL-1β反义RNA表达载体可有效抑制小鼠移植肝癌的生长,其机制与靶向阻断IL-1β表达、上调NK细胞的杀伤活性有关。; 刘艳艳梁淑娟王焕芹张素华肖伟玲吴慧娜; 关键词：肝癌白细胞介素1Β 反义RNA NK细胞

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