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大肠埃希菌GyrA突变、超广谱β-内酰胺酶及整合子检测分析被引量：3: 2010年; 目的研究大肠埃希菌(ECO)GyrA突变、产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因型及整合子的存在情况。方法 8株ECO在2008年分别分离自同一起由猪霍乱沙门菌引起的食物中毒事件中8例腹泻患者的粪便;使用K-B法进行药物敏感试验,并检测是否产ESBLs;PCR法扩增ECO对环丙沙星耐药相关基因gyrA,ESBLs基因blaTEM、blaSHV和blaCTX-M,3类整合酶基因(intⅠ1,intⅠ2,intⅠ3)和第Ⅰ类整合子可变序列;对PCR产物进行测序分析;使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对ECO进行分子分型。结果 2株菌在GyrA的QRDR区83位Ser→Leu和87位Asp→Asn,同时产TEM1和携带第Ⅰ类整合子;1株菌在QRDR区83位Ser→Leu,同时产TEM55;1株菌在QRDR区83位Ser→Leu;2株菌分别产TEM1和TEM55;整合子所携带的耐药基因盒为aacA4、cmlA1、dfrA1和aadA1;PFGE将8株菌分为8个PFGE型。结论 GyrA突变、产ESBLs和携带整合子是ECO产生耐药的重要机制。; 王志锐苏旭刘广文井良义董杰; 关键词：大肠埃希菌耐药超广谱Β-内酰胺酶整合子

分子生物学中报告基因的主要类型及应用现状被引量：4: 2011年; 报告基因技术在分子生物学领域中已经广泛应用于基因表达调控、启动子活性分析、信号转导、受体功能鉴定以及基因治疗、药物筛选等领域,而且随着技术和检测方法的进步,不断有新的更加灵敏和非损伤性的报告基因出现,尤其是一些不影响细胞繁殖、能够实时检测的荧光报告基因的发展更为迅速。该文从报告基因的使用现状出发,对其主要的种类、特征、应用及发展趋势进行论述。; 刘广文苏旭丁建清阚飙; 关键词：报告基因绿色荧光蛋白萤火虫荧光素酶

Rluc报告基因在大肠杆菌中的表达及检测条件优化: 2011年; 目的研究海肾荧光素酶报告基因(Rluc)在大肠杆菌中的表达情况及优化检测条件。方法将Rluc克隆入大肠杆菌JM109,提取质粒后用EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切,并与制备好的pET-30a(+)载体连接,再转化入大肠杆菌BL21。然后用ViviRen底物检测不同稀释液、不同浓度及时间等情况下重组克隆子中Rluc报告基因的荧光表达量,绘制表达曲线。结果成功构建了Rluc在BL21中的表达克隆子;ViviRen底物用PBS稀释比用LB稀释的检测灵敏度高约2倍;荧光检测的表达曲线在底物加入后迅速上升,至10 min时达高峰,然后缓慢下降;阳性克隆子中Rluc的荧光表达线性检测范围广,阴性对照菌株中背景低;总结出了ViviRen底物用PBS稀释、荧光信号在10 min后进行瞬时测定等优化检测条件。结论 Rluc报告基因可在大肠杆菌内高效表达,检测方法具有特异性好、灵敏度高等特点。; 刘广文董杰闫梅英苏旭井良义郭凤华阚飙; 关键词：BL21

霍乱弧菌中TLC基因簇的变异性分析: 2011年; 目的:研究霍乱弧菌中TLC基因簇的分子组成特征和类型检测方法的建立。方法:针对TLC基因簇内部的特征性基因设计结构相关引物和探针,利用序列比对、PCR和核酸杂交等分子生物学方法,检测并验证TLC在菌株内的基因结构和排列方式,确定分布类型。结果:pTLC与TLC基因簇之间序列有变异,TLC多整合于染色体中;建立了TLC基因簇的组成类型检测方法,并发现3种不同的结构排列方式。结论:TLC基因簇类型检测方法的建立及变异性的研究,利于深入揭示其在霍乱进化和毒力转移等过程中的影响作用。; 刘广文闫梅英王志锐董杰郭凤华阚飙; 关键词：霍乱弧菌 TLC PCR

霍乱弧菌毒力相关基因ctxAB、zot、cri特征分析研究被引量：2: 2010年; 目的在分子水平上了解霍乱弧菌毒力基因的分布特点和变迁及其流行规律。方法采用PCR方法对1964—2008年天津市疾病预防与控制中心分离、保存的176株霍乱弧菌的CTXΦ基因元件中的ctxAB、zot基因,TLC因子中的cri基因进行检测。结果176株霍乱弧菌中,有131株携带CTXΦ遗传单元中的ctxAB、zot基因,阳性率分别为72.72%(128/176),73.30%(129/176),TLC因子中cri基因的阳性率为40.34%(71/176)。在1964—1996年间分离的O1群霍乱弧菌中,有69.00%(69/100株)携带cri基因,而1998—2008年间分离的霍乱弧菌中cri基因的阳性率仅为1.33%(1/75)。1株O139群霍乱弧菌ctxAB、zot、cri均呈阳性。结论毒力相关基因检测能反映不同年代菌株间的分子特征,对于霍乱的分子流行病学研究具有重要意义。; 刘蕾刘广文王志锐董杰井良义苏旭陈锦英; 关键词：基因霍乱弧菌毒力基因聚合酶链式反应

多药耐药肺炎克雷伯菌GyrA突变及超广谱β-内酰胺酶基因型研究被引量：4: 2010年; 目的研究多药耐药肺炎克雷伯菌GyrA突变及超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因型。方法对2008年分离的46株肺炎克雷伯菌〔(30株分离自零售食品(凉拌菜),16株分离自医务人员鼻腔拭子)〕采用K-B法进行药敏试验,检测多药耐药菌是否产ESBLs,PCR法扩增多药耐药菌环丙沙星耐药相关基因gyrA,ESBLs基因bla-TEM、blaSHV和blaCTX-M,3类整合酶基因(intⅠ1,intⅠ2,intⅠ3)及第1类整合子可变序列;对PCR产物进行测序分析,脉冲场凝胶电泳(PFGE)对多药耐药菌进行分子分型。结果 9株菌为多药耐药菌,3株菌在GyrA的QRDR区83位Ser→Ile,1株菌在GyrA的QRDR区83位Ser→Thr,8株菌产ESBLs,6株菌携带SHV型ESBL,其中3株菌同时携带TEM型ESBL;2株菌携带OKP型ESBLs;未检测到CTX-M型ESBLs,1株菌intⅠ1基因阳性,携带有第1类整合子和耐药基因盒aacA7,PFGE将9株菌分为8个PFGE型,2株菌为同一个PFGE型。结论耐药基因的获得如gyrA基因突变和携带ESBLs基因是肺炎克雷伯菌产生多药耐药的主要机制。; 苏旭王志锐刘广文井良义董杰; 关键词：肺炎克雷伯菌耐药 GYRA 超广谱Β-内酰胺酶

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国家自然科学基金(30700678)