国家自然科学基金(30571887)
- 作品数：4 被引量：15H指数：1
- 相关作者：袁健东连小峰侯铁胜傅强陈元贵更多>>
- 相关机构：第二军医大学上海交通大学附属第六人民医院温州医学院附属第一医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金上海市青年科技启明星计划中国博士后科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- Lentivirus载体对许旺细胞的转染效率
- 2014年
- 背景:近年来研究较多的LV载体,因其强大的转染能力以及较高的转染效率等特点,在基因转染的实验中应用越来越广泛。目的:进一步验证Lentivirus载体在体外对原代许旺细胞的转染效率。方法:以Lentivirus三质粒系统构建病毒载体,在体外分别以MOI值为1,5,10,20,40对原代大鼠许旺细胞进行转染,转染后第1,3,5,7,9天在荧光显微镜下观察Lentivirus携带的荧光表达情况,并在显微镜的计数方格内计算细胞的转染情况。发出绿色荧光的为转染成功的许旺细胞,否则认为没有转染病毒载体的,从而算出转染效率。结果与结论:在病毒转染3 d后,在各不同MOI值的培养孔中,均能观察到极少量的荧光反应,在第5天时,荧光数量较前明显增多。第7天时达到高峰,第9天的荧光数量与第7天变化不明显。从细胞转染效率来看,不同的MOI值明显不同,MOI值为1时的转染效率约为45%,MOI值为5时为80%,MOI值为10时为90%,MOI值为20时为78%,MOI值为40时转染效率为70%。
- 连小峰徐建广曾炳芳周蔚孔维清张涛侯铁胜
- 关键词：慢病毒属许旺细胞转染病毒载体转染效率绿色荧光蛋白
- 慢病毒介导人神经营养素3基因在许旺细胞中的表达被引量：1
- 2009年
- 背景:神经营养素3是目前发现的在脊髓损伤修复中作用最强的神经营养因子,它能有效促进再生轴突穿越胶质瘢痕组织,从而修复脊髓损伤。目的:构建含有人神经营养素3基因的重组慢病毒载体(LV-hNT3),观察转染后人神经营养素3基因在许旺细胞中的表达。设计、时间及地点:观察性实验,于2007-06/2008-03在长海医院中心实验室完成。材料:取新生3d的SD乳鼠双侧坐骨神经,用于许旺细胞的培养及鉴定;慢病毒三质粒系统pGC-E1-EGFP,pHelper1.0和pHelper2.0为上海吉凯基因化学技术有限公司产品。方法:通过双限制性内切酶消化和连接的方法构建pGC-E1-hNT3-EGFP质粒,接着该质粒转化感受态的大肠杆菌E.coliDH5α,通过PCR及基因测序鉴定阳性克隆,再经Lipofectamine2000将pGC-E1-hNT3-EGFP,pHelper1.0和pHelper2.0三质粒系统共转染293T细胞包装病毒,按照病毒感染复数=1,4,8,10,12加入预先混好重组病毒完全培养液2mL,通过增强型绿色荧光蛋白的表达测定收集的病毒滴度。将慢病毒转染许旺细胞,以未经转染的许旺细胞和经空载的慢病毒转染的许旺细胞为对照组。主要观察指标:慢病毒转染许旺细胞后,检测转染效率,通过实时荧光聚合酶链反应和蛋白免疫印迹检测人神经营养素3在许旺细胞中的表达。结果:实验中重组质粒的外源基因序列与GeneBank中的人神经营养素3阅读框架序列完全一致;浓缩后病毒滴度为5×107TU/L,LV-hNT3感染许旺细胞后,许旺细胞发出明亮的绿色荧光,当感染复数=10时转染效率最高达85%,实时荧光PCR检测表明人神经营养素3mRNA在人神经营养素3-许旺细胞中高效表达,而对照组中未表达,蛋白免疫印迹证实人神经营养素3在许旺细胞中表达。结论:实验构建的含有人神经营养素3基因的慢病毒载体能感染许旺细胞并且高效表达人神经营养素3。
- 袁健东傅强连小峰侯铁胜赵杰
- 关键词：慢病毒许旺细胞基因转染神经营养素3
- 自制编织型三维支架对体外神经膜细胞生长的影响及体内降解观察
- 2009年
- 目的:自制聚乙交酯-丙交酯(polylactide-co-glycolide acid,PLGA)神经组织工程三维支架,观察该支架对体外神经膜细胞生长的影响及其体内降解情况及炎症反应,为后续研究奠定基础。方法:通过熔融、纺丝、拉伸、编织等步骤制作编织型三维PLGA支架,扫描电镜观察内部微管道的排列规律,测量微管道孔径大小。将原代培养的神经膜细胞接种到编织型三维支架上,采用倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞在支架上生长、黏附、增殖和凋亡情况,并与细胞培养皿和胶原海绵培养细胞进行对照。将携带神经膜细胞的三维支架植入大鼠脊柱两侧肌肉中,H-E染色观察支架在体内的降解情况及炎症反应。结果:支架外径为3mm,微管道直径为100μm,均匀平行排列。三维支架与细胞培养皿中的神经膜细胞细胞黏附率、增殖率无统计学差异,与胶原海绵培养细胞差异有统计学意义(P<0.05);三维支架与胶原海绵上的细胞凋亡率无统计学差异,二者均低于细胞培养皿培养细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。三维支架植入体内12周后完全降解,周围无明显炎性细胞浸润。结论:自制编织型三维支架对体外神经膜细胞生长无不良影响,体内能有效降解,具有良好的生物相容性。
- 袁健东傅强陈志明李忠海徐浩
- 关键词：生物相容性神经膜细胞
- 植块法与酶消化法结合培养原代大鼠雪旺细胞被引量：14
- 2008年
- 目的:探讨利用植块法与酶消化法相结合培养大鼠原代雪旺细胞的可行性,并研究其增殖规律。方法:取10只新生2～3d的SD大鼠双侧坐骨神经,剥除神经外膜,剪成约1mm3大小的碎块,用0.03%胶原酶和0.25%胰蛋白酶按1∶2对神经碎块消化12min,加入少量含10%胎牛血清的DMED培养基小心吹打细胞及组织块,再植于培养皿中培养。用S-100免疫组化染色鉴定雪旺细胞,结合Hoechst3342染色计算其纯度,在显微镜下确定细胞数量。结果:在植块培养24h后即有大量细胞迁出,2～6d细胞生长迅速,10d以后生长较为缓慢,其倍增时间为2.3d。经S-100染色证实所培养细胞为雪旺细胞,结合Hoechst3342染色可得其培养8d时纯度为95.1%,传代后纯度可达96.3%。10只新生鼠培养12d后可得细胞数约为4.8×106个。结论:利用植块法与酶消化法相结合的方法可以迅速获得大量高纯度的雪旺细胞,其增殖速度在前6d最快,倍增时间为2.3d。
- 连小峰侯铁胜傅强袁健东金根洋陈元贵
- 关键词：雪旺细胞细胞培养消化法
