国家高技术研究发展计划(2002AA2Z3317)
- 作品数：6 被引量：18H指数：3
- 相关作者：杨富强陈光明饶桂荣莫国玉王鹏更多>>
- 相关机构：解放军第458医院南方医科大学南方医院上海交通大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生轻工技术与工程化学工程生物学更多>>
- 治疗性双质粒HBV DNA疫苗制品中SDS残留量的测定被引量：3
- 2010年
- 目的应用吖啶橙分光光度法来检测HBVDNA疫苗双质粒制剂中的十二烷基硫酸(sodium dodecyl sulfate,SDS)残留量。方法将SDS标准品按不同浓度与吖啶橙混合作用后,经甲苯萃取,再测定A499值,制定出相应的标准曲线。根据待测样品的A499值,求出其SDS浓度。结果SDS浓度在0～0.0032%的范围内,线性关系良好,相关系数r>0.99,而SDS浓度在0～0.0064%的范围,曲线的相关系数r仅为0.96。因此,应采用在0～0.0032%的范围的标准曲线。待测样品三批制剂的SDS残留量均小于0.002%,表明制剂的SDS残留合格,检测结果稳定可靠。结论建立了检测HBVDNA疫苗双质粒制剂中SDS残留量的实验方法,为进一步的终产品质量控制及后续的实验研究奠定了基础。
- 吴庆洲饶桂荣杨富强陈光明
- 关键词：HBVDNA疫苗吖啶橙SDS
- 抗HBV的治疗性双质粒DNA疫苗的构建及初步药效学研究被引量：4
- 2008年
- 目的:构建抗乙型肝炎病毒(HBV)的治疗性DNA疫苗并进行体外、体内鉴定。方法:采用PCR技术扩增含有HBV包膜中蛋白(preS2.S)抗原基因和hIL-2/hIFN-γ融合蛋白的基因,将目的基因分别亚克隆于pVAX1真核表达载体,并进行酶切和测序分析;转染双质粒于COS-7细胞检测基因及蛋白表达情况;利用Combinatotial Extension(CE)软件模建分析佐剂质粒表达融合蛋白的空间结构;双质粒联合在体电脉冲技术(EP)注射BALB/c小鼠以检测特异性的体液和细胞免疫应答。结果:经酶谱和测序分析表明,构建的双质粒pVAX1/S2.S(pS2.S)和pVAX1/IL-2IFN-γ(pIIF)的基因片段的方向、序列完全正确;ELISA法定量检测双质粒转染COS-7细胞后48小时目的基因(preS2.S和hIL-2/hIFN-γ)的蛋白表达水平较高,HBsAg、IL-2、IFN-γ的含量分别为45.1、10.03、11.5ng/ml;模拟空间结构分析表明佐剂质粒的融合蛋白中两细胞因子的活性部位均裸露在外;小鼠免疫试验结果表明,疫苗pS2.S能诱导健康小鼠的保护性抗-HBs的抗体产生,且具有剂量相关性;佐剂pIIF可显著增强疫苗pS2.S质粒的免疫效果;在EP辅助作用下,质粒pS2.S和pIIF共肌注BALB/c小鼠,低剂量就能诱导较强特异性的细胞和体液免疫。结论:成功构建了抗HBV的DNA疫苗pS2.S及佐剂pIIF质粒,并具有较特异的体内外活性。
- 饶桂荣杨富强莫国玉陈光明
- 关键词：DNA疫苗转染
- 治疗性双质粒HBV DNA疫苗的纯化与检定被引量：1
- 2007年
- 目的研究双质粒HBVDNA疫苗(pS2.S和pFP)的纯化工艺,并建立质控标准。方法首先对两工程菌(DH5α/pS2.S和DH5α/pFP)的高效发酵菌体采用碱裂解法进行质粒初提;然后通过三步柱层析(依次为分子筛层析、亲和层析、阴离子层析)进行质粒纯化,并检测质粒含量、超螺旋比例、内毒素等,最后对终产品质粒溶液进行全面质量检定。结果质粒初提液通过分子筛层析后,去除了大量的RNA、宿主DNA、内毒素等,再经亲和柱纯化后获得了高比例的超螺旋质粒DNA,达95%,最后经阴离子柱层析有效去除内毒素,并浓缩了质粒,质粒得率为0.9～1.1mg/g菌,质粒总回收率达78%。三批终产品全面质量检定均符合规定。结论建立了稳定的双质粒HBVDNA疫苗(pS2.S和pFP)的纯化工艺及质量控制标准,为进一步研究奠定基础。
- 饶桂荣黄明杨富强莫国玉刘惠萍陈光明
- 关键词：DNA疫苗质粒纯化
- 治疗性双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺研究被引量：5
- 2007年
- 目的研究双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺。方法首先通过计算质粒拷贝数，检测工程菌DH5α/pS2．S和DH5α/pFP在传代过程中的遗传稳定性，通过摇瓶培养确定培养基组成，再在30L发酵罐内，通过改变培养基成分、培养时间、补料方式，确定最佳发酵参数。并将确定的最佳发酵参数应用于50L发酵罐连续3批中试规模的发酵，同时考察在发酵培养过程中质粒稳定性和超螺旋质粒DNA的比例。结果工程菌DH5α/pS2．S和DH5α/pFP在连续传代30次后，质粒拷贝数保持稳定。确定最佳发酵参数为以甘油为碳源的培养基培养，梯度恒速流加方式补料，培养时间为10h。通过3批稳定发酵，最终可获得湿菌58．0～71．8g／L，质粒含量可达到1．11～1．58mg／g菌，超螺旋质粒DNA的比例达93％以上。结论已建立了稳定的双质粒HBV DNA疫苗工程菌中试发酵工艺，为进一步规模化生产奠定了基础。
- 饶桂荣黄英王鹏何晓嫱杨富强莫国玉陈光明
- 关键词：DNA疫苗工程菌发酵
- IL-2/IFN-γ融合蛋白基因质粒联合HBV DNA疫苗治疗HBV转基因小鼠效果评价被引量：3
- 2008年
- 目的评价融合蛋白基因质粒(pFP)联合在体电脉冲(EP)介导的HBVDNA疫苗(pS2.S)免疫HBV转基因(Tg)小鼠的治疗效果。方法HBVTg小鼠随机分成3组,每组5只,分别为pS2.S+pFP、pS2.S+pcDNA3.1免疫治疗和pcDNA3.1对照组,联合免疫质粒总剂量40μg/只,按1∶1比例混合接种。初次免疫后第4、8周分别进行第一、二次增强免疫,免疫前后分别检测血清学、组织学及HBV特异性免疫应答。结果HBVDNA血清定量检测结果,pS2.S+pFP组免疫第8周(13317±2539)拷贝/ml、第12周(6462±3359)拷贝/ml时分别较免疫前(36159±7769)拷贝/ml明显减低,差异具有统计学意义(P<0.01);pS2.S+pcDNA3.1组第4周(20618±9523)拷贝/ml及第8周(23818±5319)拷贝/ml时均较其免疫前水平(36090±4421)拷贝/ml明显降低(P<0.01),但不能持续到12周(27691±13071)拷贝/ml,并明显高于此时pS2.S+pFP组水平,差异有统计学意义(P<0.01);观察终点(12周)pS2.S+pFP组Tg小鼠个体血清HBVDNA及肝组织HBsAg表达水平降低的同时,伴随其血清ALT水平及HBsAg特异性IFN-γ分泌细胞数目的升高。结论Th1类细胞因子IL-2/IFN-γ融合蛋白基因表达质粒能够增强HBVDNA疫苗抑制Tg鼠HBVDNA复制和表达的治疗作用。
- 杨富强陈光明饶桂荣徐宇虹赵勇刚何晓嫱孙希海侯金林
- 重组人白细胞介素2-干扰素γ融合蛋白结构建模与活性分析被引量：2
- 2010年
- 目的验证重组人白细胞介素2(IL-2)-干扰素γ(IFN-γ)融合蛋白的生物活性。方法应用同源建模,构建了该融合蛋白的三维结构模型,并进行能量优化。结果通过与天然蛋白的三维结构比对,证明各组份在融合蛋白的折叠中,其骨架基本没改变;各组份活性部位并未被屏蔽,且可以与相应的受体对接,最终的结构可靠性评分较高,为其生物学活性提供了结构学依据。分子动力学模拟显示,融合蛋白的连接肽具有一定柔性,为融合蛋白两个组份分别行使各自功能提供了基础。结论重组人IL-2-IFN-γ融合蛋白具有天然的IL-2和IFN-γ的生物学活性。
- 吴庆洲饶桂荣杨富强陈光明
- 关键词：蛋白质结构预测同源建模融合蛋白
