国家自然科学基金(30300316)
- 作品数：3 被引量：6H指数：2
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- 一种新型慢病毒载体制备体系的初步建立被引量：3
- 2007年
- 为了建立新型、高产量的慢病毒载体制备体系,将构建好的主框架质粒pVECRNA、包装质粒pGAGPOL及包膜质粒pVSVG通过脂质体共转染至BHK21细胞.再用含有T7RNA聚合酶基因的重组痘苗病毒vTF-3感染细胞,培养4天后,收集培养上清.提取培养上清的RNA,进行RT-PCR反应,将培养上清进行免疫印迹鉴定,将培养上清感染正常的293T细胞、HepG2细胞、Vero细胞,荧光显微镜下观察细胞GFP的表达情况,采取3×3×3析因分析方法,优化系统产量,Real-timePCR方法测定细胞培养上清中病毒载体的拷贝数,利用流式细胞术检测病毒载体滴度.RT-PCR及p24免疫印迹结果均提示在细胞上清中存在慢病毒载体;通过荧光显微镜观察到感染组293T细胞、HepG2细胞、Vero细胞均表达绿色荧光蛋白GFP,说明此系统制备出的慢病毒载体具有感染性;系统经优化后,培养上清中慢病毒载体拷贝数达到1.1×1012/ml,培养上清原始滴度达到1.3×108tu/ml,高出目前常用制备体系产量1个数量级.上述结果表明,新型慢病毒载体制备体系已初步建立,为今后该系统的大规模应用提供客观的科学依据.
- 马强李明董文其吴英松
- 关键词：慢病毒载体痘苗病毒基因治疗
- 以痘苗病毒为辅助病毒生产慢病毒载体的探究被引量：3
- 2006年
- 目的建立新型、高产量的慢病毒衍生载体的生产体系。方法构建主框架质粒pVECRNA、包装质粒pGAGPOL及包膜质粒pVSVG。通过脂质体将这三个质粒共转染至BHK21细胞,再用含有T7RNA聚合酶基因的重组痘苗病毒vTF-3感染细胞,培养4d后,收集培养上清,0.22μm滤膜过滤。结果将培养上清进行RT-PCR反应,结果能扩增出96bp长度的目的条带,将培养上清感染BHK21细胞,检测到BHK21细胞中GFP的表达,测定病毒载体滴度为(1.45±0.30)×107tu/ml。结论已初步生产出慢病毒载体,为下一步生产系统建立,系统产量优化奠定良好基础。
- 马强李明吴英松
- 关键词：慢病毒载体基因治疗
- 一种新型慢病毒载体制备方法的建立
- 2007年
- 为了建立新型、高产量的慢病毒载体制备体系,将构建好的主框架质粒pVECRNA、包装质粒pGAGPOL及包膜质粒pVSVG通过脂质体共转染至BHK21细胞,再用含有T7RNA聚合酶基因的重组痘苗病毒vTF-3感染细胞,培养4d后,收集培养上清,提取培养上清的RNA,进行RT-PCR反应;将培养上清进行免疫印迹鉴定;将培养上清感染正常的293T细胞、HepG2细胞、Vero细胞,荧光显微镜下观察细胞GFP的表达情况;采取3*3*3析因分析方法,优化系统产量,Real-time PCR方法测定细胞培养上清中病毒载体的拷贝数,利用流式细胞术检测病毒载体滴度。RT-PCR及p24免疫印迹结果均提示在细胞上清中存在慢病毒载体;通过荧光显微镜观察到感染组293T细胞、HepG2细胞、Vero细胞均表达绿色荧光蛋GFP,说明此系统制备出的慢病毒载体具有感染性;系统经优化后,培养上清中慢病毒载体拷贝数达到(11.71±0.80)×1011copies/mL,培养上清原始滴度达到(1.3±0.18)×108tu/mL,高出目前常用制备体系产量1个数量级。初步建立了新型慢病毒载体制备体系,为今后该系统的大规模应用提供客观的科学依据。
- 马强李明董文其吴英松
- 关键词：慢病毒载体痘苗病毒基因治疗
