国家自然科学基金(30971910)
- 作品数：8 被引量：19H指数：3
- 相关作者：郭巍赵丹徐大庆刘小民李瑞军更多>>
- 相关机构：河北农业大学北京农学院河北省生物研究所更多>>
- 发文基金：国家现代农业产业技术体系建设项目国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 棉铃虫围食膜肠粘蛋白基因HM72的克隆、表达及其蛋白组织定位被引量：3
- 2011年
- 围食膜是昆虫中肠上皮细胞分泌形成一层特有的非细胞性半透膜,肠粘蛋白是其重要的组成成分。本研究利用棉铃虫Helicoverpa armigera围食膜蛋白多克隆抗体免疫筛选棉铃虫中肠cDNA表达文库,共获得385个阳性克隆,经DNA测序和序列对比,确认其中之一为编码棉铃虫中肠围食膜肠粘蛋白的cDNA克隆HM72。序列分析显示,该cDNA全长为2888bp(GenBank登录号:HM017910),其中ORF长2469bp,编码823个氨基酸,包含起始密码子ATG和终止密码子TAA,在poly A末端上游19bp处有一个多聚腺苷酸信号序列AATTAA。氨基酸序列分析表明,其N-端含有16个氨基酸的信号肽,预测分子量为84.2kDa,等电点3.63,为酸性蛋白质。结构域分析表明,该蛋白具有5个几丁质结合功能域,一个粘蛋白结构域和两个甘氨酸-天冬氨酸富集区,该基因成功表达100kDa的目的蛋白。Western blot分析表明,HM72蛋白存在于棉铃虫中肠、围食膜、粪便及蜕中,并由整个中肠分泌,而在棉铃虫脂肪体、体壁、马氏管、唾腺、消化液、血淋巴中没有检测到HM72蛋白。
- 刘小民李杰郭巍徐大庆张霞
- 关键词：棉铃虫中肠上皮细胞围食膜CDNA表达文库
- 棉铃虫羧酸酯酶基因cDNA的克隆、表达及活性分析被引量：7
- 2011年
- 【目的】克隆棉铃虫中肠羧酸酯酶基因,了解该酶的分子特性,为研究棉铃虫抗药性机理奠定基础。【方法】制备抗血清,对棉铃虫(Helicoverpa armigera(Hübner))中肠cDNA表达文库进行免疫筛选,得到编码棉铃虫羧酸酯酶基因的cDNA克隆,利用生物信息学软件和网站进行序列分析,构建原核表达载体进行表达,并以α-醋酸萘酯溶液为底物进行活性测定。【结果】测序分析表明,羧酸酯酶基因hc3(GenBank登录号:GU119888)全长2 896 bp,编码795个氨基酸。羧酸酯酶HC3的等电点pI为3.94,活性中心包括3个氨基酸残基(催化三联体):Ser204,Glu331,His444;第545—773位包含大量高度重复的Gly,Asp、Glu(GDE区域)构成亲水区。该基因在大肠杆菌BL21中成功表达约100 kD的HC3蛋白,检测表达的羧酸酯酶活性为0.32 mmol/100μL酶液。【结论】成功克隆、表达了棉铃虫羧酸酯酶蛋白HC3,并发现GDE亲水结构域。为进一步了解羧酸酯酶的三维结构及其水解作用并设计新型杀虫剂提供了可能。
- 刘小民李杰郭巍张霞李新娜
- 关键词：棉铃虫CDNA表达文库羧酸酯酶活性分析
- 棉铃虫围食膜肠粘蛋白HaIIM72真核表达及几丁质结合活性检测
- 2013年
- 在前期工作中,本实验室已成功克隆得到棉铃虫粘蛋白基因haiim72。为了研究粘蛋白HaIIM72的生化特性,本试验将haiim72基因克隆到质粒pFastBacTM,转化大肠杆菌DH10Bac,构建重组杆状病毒bacmid-hai-im72,转染昆虫细胞系BTI-TN-5B1-4(HighFive)从而在昆虫细胞系中进行表达。结果表明:成功表达了分子量约260kDa的棉铃虫围食膜肠粘蛋白HaIIM72。几丁质结合活性试验表明,肠粘蛋白HaIIM72具有几丁质结合活性,能够被较强的变性剂洗脱,属于第三类围食膜蛋白。
- 张晓刚郭巍徐大庆赵丹孙伟明单鸣
- 关键词：棉铃虫围食膜真核表达
- 华北大黑鳃金龟成虫周年发生动态及影响因素分析被引量：2
- 2015年
- 华北大黑鳃金龟[Holotrichia oblita(Faldermann)]是一种为害多种作物的重要地下害虫,为了解其近年的发生动态以便针对性防治,于2010-2013年对其成虫出土规律进行了周年系统研究,并对其发生期和发生量影响因素进行了初步分析。结果表明,2010-2013年华北大黑鳃金龟的出土盛期仍在5月份,与文献相比总体一致,但出土期略滞后并且时间有所延长;而2013年始发期明显晚于其他年份,对其气象因素分析发现,2013年春季干旱,首次降雨在5月26日,明显晚于其他年份,其始发期也较其他年份偏晚,说明土壤湿度可能影响成虫出土始期。出土盛期成虫出土量与气象因素的灰色关联度分析表明,成虫日出土量与平均相对湿度关联最密切,其次是日均温和降雨量。研究结果为华北大黑鳃金龟的预测预报以及针对性防治提供了基础。
- 梁超郭巍陆秀君李瑞军于浩海王伟赵丹徐大庆
- 关键词：华北大黑鳃金龟气象因子灰色关联度分析
- 暗黑鳃金龟幼虫羧酸酯酶基因的克隆及其在不同组织中的表达水平研究
- 2014年
- 通过对暗黑鳃金龟幼虫中肠cDNA文库的免疫筛选,得到一个编码羧酸酯酶的全长基因hc19。经NCBI Blast分析,该基因编码的氨基酸序列包含有Esterase/lipase superfamily的保守结构域,含羧酸酯酶B型丝氨酸活性位点FGGdpnkVtLaGySAG。序列比对表明,其与华北大黑鳃金龟有较高同源性。hc19在大肠杆菌中表达大约59kDa的目的蛋白条带。以α-醋酸萘酯溶液为底物与粗酶液混合,测其活性,平均酶活力为0.091mmol/100μL酶液。实时定量PCR表明羧酸酯酶基因hc19在中肠中表达量最高。
- 赵丹孙晓彤郭巍李瑞军陆秀君
- 关键词：暗黑鳃金龟CDNA表达文库
- 对华北大黑鳃金龟幼虫高毒力绿僵菌菌株的筛选及分子鉴定被引量：6
- 2014年
- 绿僵菌Metarhizium anisopliae是一类对多种害虫具有高活性的病原真菌。本研究以华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita 1龄幼虫为对象,从4株绿僵菌中筛选出1株毒力较高的菌株,命名为M7-9。采用浸渍法对华北大黑鳃金龟1龄幼虫进行毒力测定,结果表明,绿僵菌M7-9的致死率为96.67%,僵虫率为96.67%,致死中时为2.82 d;致死中浓度为1.29×106孢子/m L;绿僵菌M7-9 ITS序列分子鉴定表明该株绿僵菌为金龟子绿僵菌。
- 于浩海郭巍李瑞军陆秀君赵丹
- 关键词：金龟子绿僵菌毒力测定ITS序列分析
- 华北大黑鳃金龟丝氨酸羧肽酶在不同体系中的表达被引量：2
- 2013年
- 丝氨酸羧肽酶(Serine carboxypeptidases,SCPs)是一类在酸性pH环境下参与多肽和蛋白质的加工、修饰与降解等多个重要环节的真核生物蛋白水解酶。根据华北大黑鳃金龟丝氨酸羧肽酶(HoSCP)全长基因序列设计引物,利用PCR方法克隆hoscp基因并分别连接到表达载体pET28b和pPIC9K上,转化大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115,实现了其在原核以及真核体系中的表达。结果显示,HoSCP在原核细胞及酵母细胞中均能稳定表达50 kDa的特异蛋白。HoSCP的成功表达为其在华北大黑鳃金龟体内的活性和生物学功能研究提供了可能。
- 张雅昆赵丹郭巍刘小民徐大庆孙伟明
- 关键词：华北大黑鳃金龟原核表达系统毕赤酵母表达系统
- 暗黑鳃金龟几丁质酶基因的克隆、表达及活性分析被引量：1
- 2014年
- 本研究通过免疫筛选暗黑鳃金龟幼虫中肠cDNA表达文库,获得其几丁质酶基因Hpchi。序列分析表明Hpchi开放阅读框长1 443bp,编码480个氨基酸,预测分子量为51.4kDa。Hpchi蛋白N-端带有18个氨基酸的信号肽,C-端存在有一个几丁质结合结构域,催化区位置显示有特异活性位点,判定Hpchi蛋白属于Ⅰ型的几丁质酶。分别构建原核和真核表达载体,转化到大肠杆菌BL21和昆虫细胞系sf9,BTI-Tn-5BI-4(Highfive)中进行表达。SDS-PAGE和Western Bolt杂交试验显示,Hpchi重组蛋白在大肠杆菌及昆虫细胞系中都获得了成功表达。酶活分析表明真核表达的Hpchi重组蛋白具有几丁质酶活性。
- 邹爽赵丹郭巍徐大庆张雅昆
- 关键词：暗黑鳃金龟CDNA表达文库几丁质酶真核表达系统活性分析
