国家自然科学基金(30370534)
- 作品数：11 被引量：26H指数：2
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- 蛋白尿导致肾间质纤维化的机制研究被引量：2
- 2007年
- 梁海君杨聚荣于金秋何娅妮
- 反义cubilin RNA对白蛋白刺激肾小管上皮细胞分泌趋化因子的影响被引量：2
- 2004年
- 目的观察反义cubilinRNA对白蛋白刺激人近端肾小管上皮细胞(HK-2)表达单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、RANTES的影响。方法应用基因克隆技术构建反义及正义cubilin真核表达载体(pcDNA-ACUB、pcDNA-CUB),酶切鉴定及序列测定证实插入序列是否正确。脂质体DOTAP将其转染至HK-2细胞,流式细胞仪(FCM)检测反义cubilinRNA对HK-2细胞重吸收白蛋白的抑制作用。细胞转染72h后给予高浓度白蛋白(10g/L)刺激24h,细胞ELISA、Western印迹法检测HK-2细胞表达MCP-1、RANTES的变化。结果pcDNA-ACUB转染组白蛋白摄取率较DOTAP组显著降低(P<0.01)。与DOTAP组比较,pcDNA-ACUB转染组HK-2细胞MCP-1、RANTES的表达显著降低(P<0.001)。结论反义cubilinRNA可抑制肾小管上皮细胞对白蛋白的摄取,并能拮抗白蛋白刺激肾小管上皮细胞趋化因子的表达,提示cubilin在白蛋白介导的肾小管上皮细胞分泌趋化因子中起重要作用。
- 杨聚荣何娅妮周萍刘大维张建国陈晶
- 关键词：趋化因子HK-2
- 质粒表达型siRNA对人近端肾小管上皮细胞cubilin表达的抑制作用被引量：1
- 2007年
- 目的观察cubilinsiRNA真核表达载体对人近端肾小管上皮细胞(human renal proximal tubular epithelial cell line,HKC)cubilin基因的特异性抑制作用。方法针对人cubilin基因设计并构建siRNA真核表达载体pSUPER EGFP-C1和pSUPER EGFP-C2,转染HKC,经荧光定量PCR(FQ-PCR)检测cubilin mRNA的表达、不同浓度的人血清白蛋白(HSA)刺激正常HKC及转染重组质粒的HKC24h后cubilin mRNA的表达,并通过激光共聚焦扫描荧光显微镜观察HKC对白蛋白摄取情况的变化。结果FQ-PCR显示HSA刺激正常HKC后cubilin mRNA表达具有剂量依赖性。与正常对照组相比,两个重组质粒均可部分抑制HKC cubilin表达,抑制效率分别为66%和37%,HSA刺激转染pSUPER EGFP-C1、pSU-PER EGFP-C2的HKC后cubiin mRNA水平较正常对照组比较分别下降50%、34%,转染了重组质粒的HKC对白蛋白的摄取明显减少。结论成功地构建了针对人cubilin基因的RNA干扰真核表达载体,表达型siRNA可抑制肾小管上皮细胞cubilin基因的表达及对白蛋白的摄取。
- 林静何娅妮杨聚荣李新伦梁海君吴劲松李开龙丁涵露张建国
- 关键词：CUBILINRNA干扰SIRNA人近端肾小管上皮细胞
- 白蛋白活化肾小管上皮细胞对肾小管周微血管的影响及机制研究
- 2008年
- 目的探讨人类血清白蛋白（HSA）超负荷损伤肾小管上皮细胞后对肾间质微血管损伤的影响及可能机制。方法激光共聚焦显微镜观察肾小管上皮细胞（HKC）吞饮罗丹明标记白蛋白（TRITC—BSA）以及吞饮受体cubilin siRNA对其的抑制效应。氢化乙锭标记的荧光探针柃测白蛋白刺激HKC产生O2^-以及白蛋白乔饮受体cubilin siRNA和线粒体呼吸链复合物Ⅰ抑制剂鱼藤酮对HKC产生O2^-的抑制作用。培养上清H2O2采用化学比色方法检测。倒置显微镜下观察HSA激活的HKC以及cubilin siRNA或龟藤酮预处理的HKC与脐静脉内皮细胞（HUVEC）共培养后缸管内皮管样结构形成情况。四甲基偶氮哗盐（MTT）比色法测定内皮细胞活力。用流式细胞仪以AnnexinV FITC／PI双染法偷测内皮细胞凋亡率。结果（1）cubilin siRNA可显著抑制HKC译饮白蛋白（P〈0．05）。（2）HSA刺激HKC产生ROS呈剂量及时间依赖性（P〈0．05）；cubilin siRNA及鱼藤酮均可抑制门蛋门超负荷诱导HKC产牛大垃ROS（P〈0．05）。（3）HKC与HUVEC共培养体系中，HSA活化的HKC抑制内皮细胞管样结构的形成，内皮细胞增殖显著减少（P〈0．05），细胞凋亡率显著增高（P〈0．05）；而cubilin siRNA和鱼藤酮干预组内皮细胞管样结构数及内皮细胞活力显著增加（P〈0．05），细胞凋亡率显著降低（P〈0．05）。结论白蛋白可通过乔饮受体cubilin激活肾小管上皮细胞线粒体呼吸链复合物Ⅰ产生大馈ROS，后者可能是慢性肾病时大量蛋白尿活化肾小管上皮细胞进而损伤肾小管周徽血管网的再要介质。
- 林静何娅妮王惠明李开龙丁涵露申海鹰杨聚荣
- 关键词：肾小管上皮细胞内皮细胞白蛋白活性氧
- 腺病毒介导Cubilin反义RNA对肾小管上皮细胞Cubilin蛋白诱导表达的抑制作用被引量：2
- 2006年
- 目的构建细菌内同源重组型的Cub ilin反义RNA腺病毒表达载体并研究其对肾小管上皮细胞Cub ilin蛋白诱导表达的影响。方法PCR扩增大鼠Cub ilin起始编码区767 bp的DNA片段,与T载体连接,测序鉴定连接方向,通过选择反向和同向的双酶切位点与腺病毒穿梭载体pAdtack-CMV同时酶切和连接,构建反向插入(正向插入作为对照)的腺病毒穿梭载体。将Pm eⅠ线性化的腺病毒穿梭载体pAdtack-ACUB和pAdtack-CUB转染包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的受体菌B J5183(AdEasyTMXL)进行同源重组。用含有卡那霉素的LB平板筛选同源重组阳性的克隆,PacⅠ酶切和测序鉴定后,转染包装细胞(293细胞),经病毒扩增和纯化后,再以OD法和GFP法计算重组腺病毒的滴度。经免疫印迹法分析Cub ilin反义RNA对Cub ilin蛋白质诱导表达的抑制作用。结果成功构建了Cub ilin的反义RNA腺病毒表达载体(pAdEasy-ACUB)和对照正义RNA腺病毒表达载体(pAdEasy-CUB),滴度为2.0×1010pfu/m l、1.8×1010pfu/m l;Cub ilin反义RNA腺病毒表达载体转染可明显抑制大鼠肾小管上皮细胞的Cub ilin蛋白的诱导表达。结论Cub ilin的反义RNA腺病毒表达载体的成功构建以及对肾小管上皮细胞Cub ilin蛋白诱导表达的明显抑制作用,为在基因水平的研究和治疗蛋白尿引起的肾间质损伤奠定了良好的基础。
- 梁海君何娅妮杨聚荣丁涵露李开龙张建国李新伦林静刘俊
- 关键词：CUBILIN腺病毒反义RNA肾小管上皮细胞
- Cubilin在白蛋白刺激肾小管上皮细胞表达MCP-1、RANTES中的作用被引量：14
- 2004年
- 目的 探讨白蛋白刺激肾小管上皮细胞表达细胞趋化因子的分子机制。方法 免疫组织化学方法检测 10例肾病综合征患者和 8例单纯血尿患者肾组织白蛋白沉积和MCP 1、RANTES的表达 ,常规染色观察肾组织病理改变。以DOTAP分别将空载体、正义或反义Cubilin核酸转染至HK2细胞 ,荧光显微镜观察HK2细胞对白蛋白的摄取情况 ,Westernblot检测HK2细胞Cubilin、MCP 1和RANTES的表达变化。结果 对照组肾组织中肾小管上皮细胞胞浆可见少量白蛋白沉积 ,MCP 1、RANTES有微弱表达 ;肾病综合征组肾小管上皮细胞胞浆可见大量白蛋白颗粒 ,MCP 1和RANTES表达明显增强 ,并可见肾间质单个核细胞浸润等组织学改变。体外实验 ,与正义Cubilin组、空载体组和DOTAP组比较 ,反义Cubilin组Cubilin表达显著下调 ,HK2细胞的白蛋白吞饮以及MCP 1、RANTES的表达减少。结论 肾小管上皮细胞对白蛋白的重吸收增加可能与其趋化因子表达上调有密切关系 ,其中Cubilin可能具有重要作用。
- 何娅妮杨聚荣蒋建新周萍刘大维申海鹰陈晶
- 关键词：白蛋白MCP-1RANTES肾小管上皮细胞白刺
- 内质网应激在白蛋白诱导肾小管上皮细胞凋亡中的作用被引量：6
- 2009年
- 目的探讨内质网应激在白蛋白超负荷诱导肾小管上皮细胞凋亡中的作用和分子机制。方法Western印迹法检测肾小管上皮细胞（HKC）内质网伴侣蛋白糖调节蛋白78（GRP78）和内质网应激蛋白CHOP（CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白，也称为GADD153）表达与人血清白蛋白（HSA）作用时间和浓度的关系。实时荧光定量PCR法检测CHOP siRNA对CHOP基因转录的抑制情况。Western印迹法检测CHOP siRNA转染后CHOP蛋白水平的变化。膜联蛋白V和碘化丙锭（Annexin V-FITC和PI）双染的流式细胞术检测白蛋白诱导HKC凋亡的变化以及CHOP siRNA对HKC凋亡的影响。结果（1）分别以0、5、10、20g／L白蛋白作用于HKC 24h，GRP78、CHOP蛋白表达及细胞凋亡均随白蛋白浓度的增加而上调，各组间差异有统计学意义（P〈0．01）；以20g／L白蛋白分别作用于HKC 0、6、12、24、36h，GRP78蛋白表达在6h即显著增加，CHOP蛋白表达及HKC凋亡则在12h显著增加，各组间差异有统计学意义（P〈0．01）。（2）CHOP siRNA显著抑制白蛋白诱导的CHOP基因转录及蛋白表达（P〈0．01），对白蛋白诱导的HKC凋亡有显著抑制作用（P〈0．01）。结论白蛋白超负荷可诱导肾小管上皮细胞发生内质网应激，并通过上调促凋亡因子CHOP表达引起肾小管上皮细胞内质网相关的细胞凋亡，这可能是蛋白尿引起肾小管间质病变的重要机制。
- 吴小玮何娅妮王惠明李开龙丁涵露吕顺巧
- 关键词：白蛋白类内质网细胞凋亡肾小管上皮细胞
- Cubilin反义RNA对大鼠肾小管超负荷重吸收白蛋白的抑制作用
- 2007年
- 目的探讨经肾动脉灌注腺病毒载体介导Cubilin反义RNA对肾小管超负荷重吸收白蛋白的抑制作用。方法建立大鼠阿霉素肾病模型,正义RNA组和反义RNA组分别经肾动脉缓慢灌注GFP基因标记的pAdEasy-Cub和pAdEasy-ACub,对照组和模型组灌注等量生理盐水。激光共聚焦显微镜下观察GFP的表达,并监测24h尿蛋白量及其他生化指标;光镜下观察肾小管间质病理变化;免疫组化法观察肾小管Cubilin基因的表达以及肾小管上皮细胞内白蛋白的沉积。结果转染第4天,正、反义RNA组肾脏GFP基因有较强表达,11d达到高峰,可持续至实验结束;反义RNA组与其他各组相比,24h尿蛋白量明显增高(P<0.01),小管间质病变轻微,Cubilin阳性表达率最低,且与白蛋白的沉积呈显著正相关(r=0.896,P<0.01)。结论经肾动脉途径灌注重组腺病毒,能器官靶向性表达外源基因;Cubilin反义RNA对肾小管超负荷重吸收白蛋白有明显的抑制作用,并可以有效地减轻蛋白尿引起的肾间质损伤。
- 刘俊何娅妮杨聚荣李开龙丁涵露张建国梁海君詹俊
- 关键词：腺病毒载体CUBILIN白蛋白反义RNA蛋白尿
- 人cubilin蛋白功能片段原核表达系统的建立被引量：2
- 2006年
- 目的构建编码白蛋白吞饮受体人cubilin(hcubilin)蛋白配体结合域CUB78基因片段的原核表达载体,诱导表达并鉴定表达产物。方法重组DNA技术构建原核表达载体pGEX hCUB78,IPTG诱导表达,SDS PAGE与免疫印迹法鉴定表达产物,Pulldown实验验证融合蛋白是否与白蛋白结合。结果双酶切和测序鉴定表明CUB78片段插入正确,诱导表达后获得分子量为52×103的融合蛋白,该融合蛋白可以被抗GST抗体识别,并且可以和白蛋白结合。结论CUB78基因片段编码的蛋白质能在原核细胞中正确表达,并且可以和白蛋白结合,这为进一步研究该功能域的结构与功能奠定了基础。
- 李新伦何娅妮杨聚荣梁海君林静李开龙丁涵露张建国
- 关键词：CUBILINPGEX-4T-1融合蛋白白蛋白
- 人cubilin蛋白与其配体白蛋白结合特定结构域的预测
- 2007年
- 目的同源模建cub8功能域的三维模型,并以计算机辅助的分子对接方法预测cub8功能域与白蛋白的候选结合氨基酸残基。方法采用insightⅡ工作站对cub8蛋白进行同源模建,对cub8蛋白和白蛋白进行分子对接,寻找白蛋白和cub8的候选结合氨基酸残基。结果cub8蛋白三维结构为两个反平行的β片层结构,中间以β转角相连。cub8蛋白片段与白蛋白通过正负电势的吸引完成受体与配体的结合。Asp59-Tyr60-Leu61-Glu62-Leu63-Tyr64和Arg72-Tyr73肽段可能是cubilin与白蛋白结合的关键氨基酸残基。结论利用计算机辅助的分子对接技术,获得cub8和白蛋白相互作用的两个候选结合域,为进一步研究cubilin与白蛋白相互作用奠定基础。
- 杨聚荣何娅妮李新伦梁海君林静吴小玮
- 关键词：同源模建白蛋白
