陕西省科技攻关计划(2010K15-08)
- 作品数：6 被引量：3H指数：1
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- 相关机构：西安交通大学医学院第二附属医院更多>>
- 发文基金：陕西省科技攻关计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 大鼠核转录因子Atoh1的克隆表达及鉴定
- 2011年
- 目的利用基因工程方法克隆SD大鼠Atoh1基因CDS区序列,构建大鼠核转录因子Atoh1的真核表达载体并在真核细胞中表达。方法从两只SD大鼠结肠黏膜提取总RNA,采用逆转录PCR法扩增Atoh1基因CDS区序列并亚克隆于PMD-19T载体中。测序鉴定后将Atoh1基因连接于含有EGFP和内部核糖体转入位点(IRES)的真核细胞表达载体pIRES2-EGFP中,对重组质粒进行酶切鉴定和测序鉴定后,以脂质体介导法转染至293T细胞,荧光显微镜和Western blot检测其在293T细胞中的表达。结果扩增得到大鼠Atoh1 CDS区长1 056 bp,编码351个氨基酸,与GeneBank公布的参考序列对比,有两处碱基发生突变,但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致,两处碱基应为单核苷酸多态性(SNP),突变为无义突变,不影响蛋白表达。双酶切和测序结果证明Atoh1已正确地克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,荧光显微镜和Western blot证实Atoh1目的蛋白能在293T细胞中稳定表达。结论基因工程方法可成功克隆出Atoh1编码序列,真核表达载体pAtoh1-IRES2-EGFP构建成功并可以在293T细胞中表达。
- 郑国玺祝康侯瑾朱珠韦俊荣许珉
- 关键词：感音神经性聋基因克隆真核表达载体
- Atoh1基因与内耳毛细胞再生
- 2010年
- 哺乳动物毛细胞的产生和内耳形态的生成是由局部细胞间相互影响以及特异的基因所调控。Atohl基因是内耳感觉细胞分化过程中的重要正性调控因子，Atohl的过度表达可产生新的具有感觉功能的毛细胞，且具有吸引神经轴突的能力。本文对Atohl基因与细胞诱导分化为内耳毛细胞的研究进行综述。
- 朱珠郑国玺祝康
- 关键词：听觉丧失
- SD大鼠Atoh1基因CDS区的克隆及序列分析
- 2011年
- 目的利用基因工程方法克隆SD大鼠Atoh1 cDNA编码序列并测定分析其克隆序列。方法采用非对称互补引物/模板法,制备Atoh1 cDNA的编码序列,将其克隆入PMD-19T载体中并测序。结果经酶切鉴定、测序分析表明,扩增得到的大鼠Atoh1基因CDS区全长为1 056 bp,编码351个氨基酸;测定序列与GenBank中公布的参考序列对比,有2处碱基发生突变,但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致。这两处碱基应为单核苷酸多态性(SNP)位点,突变为无义突变,不影响蛋白的表达。结论成功克隆了Atoh1 cDNA编码序列,为进一步对感音神经性耳聋的基因治疗奠定了基础。
- 郑国玺祝康朱珠侯瑾韦俊荣许珉
- 关键词：感音神经性耳聋基因克隆耳蜗毛细胞
- 大鼠Atoh1真核表达载体pAtoh1-IRES2-EGFP的构建及转染293T细胞的研究
- 2011年
- 目的:利用基因工程方法克隆SD大鼠Atoh1基因编码区序列,构建Atoh1的真核表达载体pA-toh1-IRES2-EGFP,并验证其在293T细胞中的表达。方法:通过RT-PCR从SD大鼠结肠组织内扩增出Atoh1基因全长CDS序列,并TA克隆于PMD-19T载体中。纯化回收的目的片段测序后连接于真核细胞表达载体pIRES2-EGFP中,构建pAtoh1-IRES2-EGFP真核表达载体。再次测序后脂质体介导重组质粒转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。结果:测序后将扩增得到的大鼠Atoh1CDS序列与GeneBank公布的参考序列对比,有两处碱基发生突变,但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致,两处碱基应为单核苷酸多态性,突变为无义突变,不影响蛋白表达。双酶切和测序结果证明Atoh1已正确地克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,重组质粒转染293T细胞24h后荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达。结论:获得正确Atoh1编码序列,真核表达载体pAtoh1-IRES2-EGFP构建成功并可以在293T细胞中表达,为进一步对感音神经性聋的基因治疗奠定了基础。
- 郑国玺朱珠祝康侯瑾韦俊荣许珉
- 关键词：听觉丧失感音神经性真核表达载体
- 大鼠Atoh1基因真核表达载体的构建及转染293T细胞的实验研究
- 2011年
- 目的利用基因工程方法克隆SD大鼠Atoh1基因CDS,构建大鼠核转录因子Atoh1的真核表达载体并在真核细胞中表达。方法从SD大鼠结肠粘膜提取总RNA,采用逆转录PCR法扩增Atoh1基因CDS区序列并TA克隆至PMD-19T载体中。测序鉴定后将Atoh1基因连接于含有EGFP和内部核糖体转入位点(internal ribosome entrysite,IRES)的真核细胞表达载体pIRES2-EGFP中,对重组质粒进行酶切鉴定和测序鉴定后,以脂质体介导法转染至293T细胞,荧光显微镜、PT-PCR和Western blot检测其在293T细胞中的表达。结果扩增得到大鼠Atoh1CDS区长1056bp,编码351个氨基酸,与GeneBank公布的参考序列对比,有两处碱基发生突变,但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致,两处碱基应为单核苷酸多态性(SNP),突变为无义突变,不影响蛋白表达。双酶切和测序结果证明Atoh1已正确地克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,转染293T细胞48h后,荧光显微镜下观察到荧光蛋白的表达,PT-PCR和Western blot证实Atoh1的mRNA和蛋白能在293T细胞中正确表达。结论成功构建了真核表达载体pAtoh1-IRES2-EGFP,并在293T细胞中成功表达,为进一步研究Atoh1的功能、作用机制及感音神经性耳聋的基因治疗奠定了基础。
- 郑国玺祝康朱珠侯瑾韦俊荣许珉
- 关键词：感音神经性耳聋基因克隆真核表达载体
- 大鼠背部毛乳头细胞的分离培养和鉴定被引量：3
- 2012年
- 目的:建立一种高效分离成年SD大鼠背部毛乳头细胞(DPCs)的方法,考察DPCs在体外培养条件下的生长特性。方法:采用改良二步酶消化法分离大鼠背部DPCs,应用相差显微镜进行形态学观察,流式细胞技术检测细胞周期,细胞计数法绘制生长曲线,流式细胞技术和免疫细胞化学法检测细胞表面分子标志。结果:分离培养的DPCs多呈短梭形,融合前细胞呈现凝集性生长趋势;传代细胞呈多角形或短梭形,传代后第3天开始呈对数生长,第9天达增殖高峰。第1、3、5代的细胞增殖时间分别为68、52和36h。流式细胞仪检测第1、3、5代细胞周期,处于G0/G1期分别为(90.21±5.13)%、(81.23±1.85)%和(75.16±5.32)%,随着传代次数的增加,G0/G1期细胞比例逐渐下降,但仍大部分处于静止期;经免疫化学SABC法染色显示,α-SMA抗体表达阳性,CK抗体表达阴性,细胞表面分子表达CD44、CD90,但不表达CD34。结论:改良二步酶消化法能成功分离培养成年SD大鼠背部DPCs,体外培养的DPCs与干细胞的生物学特性相吻合,有望成为一种新的细胞替代疗法的种细胞来源。
- 郑国玺朱珠祝康侯瑾韦俊荣夏翠许珉
- 关键词：毛乳头细胞间充质干细胞真皮
