辽宁省科技厅科技攻关项目(200925009-9)
- 作品数：3 被引量：0H指数：0
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- E1A激活基因阻遏子蛋白与细胞膜受体IGF2R(11～13)结构域作用抑制人血管平滑肌细胞迁移
- 2012年
- 目的研究人E1A激活基因阻遏子基因(CREG)蛋白在人血管平滑肌细胞迁移中的作用。方法构建含有myc和His标签的野生型CREG(wtCREG)和去糖基化突变型CREG(mCREG)真核表达载体pcDNA3.1myc-His/wt/mCREG。转染人293F细胞株,Ni-NTA亲合层析方法纯化获得wtCREG和mCREG蛋白;将重组wt-CREG(400 nmol/L)及mCREG蛋白(400 nmol/L),分别加入体外培养的低表达CREG的人血管平滑肌细胞OB2中,应用Western blot、细胞刮伤实验、明胶酶电泳方法观察两种重组人CREG蛋白对人血管平滑肌细胞迁移和分化等生物学行为的影响;通过不同浓度(2、4、8 mg/L)的胰岛素生长因子2受体(M6P/IGF2R)中和抗体与人M6P/IGF2R细胞外结构域蛋白小肽分别进行阻断实验,分析M6P/IGF2R是否参与介导CREG蛋白对平滑肌细胞迁移的调控。结果刮伤实验发现,加入最佳效应浓度的wtCREG和mCREG蛋白24 h后,OB2组细胞的迁移能力均明显下降;明胶酶电泳和Western blot检测结果也证实,两种重组CREG蛋白均可以使细胞外基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9的合成及活性减少,而组织金属蛋白酶抑制物表达则明显增加;同时,Western blot分析也证实,平滑肌细胞分化标志蛋白myocardin、SMα-actin、肌球蛋白重链和caldesmin表达增加,LM-1和FN表达减少。提示两种重组CREG蛋白均能够抑制体外培养的人血管平滑肌细胞迁移,促进其分化。IGF2R中和抗体和IGF2R小肽阻断实验证实:不同浓度的Anti-M6P/IGF2R能有效阻断两种CREG蛋白对人血管平滑肌细胞迁移和细胞外基质合成的调控作用。并且,M6P/IGF2R的第11～13结构域小肽片段对wt/mCREG蛋白的生物学效应也有明显的阻断作用。结论重组CREG蛋白可能通过细胞膜表面M6P/IGF2R的11～13结构域抑制人血管平滑肌细胞迁移和细胞外基质分泌,维持细胞分化。
- 闫承慧孙鸣宇张效林徐凯李毅王效增韩雅玲
- 关键词：平滑肌细胞迁移
- E1A激活基因阻遏子蛋白对抗人脐静脉血管内皮细胞的凋亡
- 2012年
- 背景:前期研究显示,E1A激活基因阻遏子能够通过抑制动脉平滑肌细胞的凋亡对抗动脉粥样硬化。目的:进一步阐明E1A激活基因阻遏子在内皮细胞凋亡中的作用。方法:通过去血清方法诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞凋亡,然后进行TUNEL和caspase-3的活性检测。结果与结论:伴随着E1A激活基因阻遏子的表达下降,内皮细胞的凋亡增多。功能获得和功能缺失分析显示:E1A激活基因阻遏子过表达后能够明显抑制内皮细胞的凋亡,而E1A激活基因阻遏子表达减少可以明显增加诱导内皮细胞的凋亡。进一步应用Western blot分析显示:E1A激活基因阻遏子对于内皮细胞凋亡的保护作用主要通过激活PI3K/AKT信号通路介导。提示E1A激活基因阻遏子对抗去血清诱导的内皮细胞凋亡中具有重要的作用。并且,E1A激活基因阻遏子抑制的内皮细胞凋亡可能通过PI3K/AKT信号转导通路。
- 闫承慧王娜陶杰李毅王效增韩雅玲
- 关键词：E1A激活基因阻遏子动脉内皮凋亡动脉粥样硬化人脐静脉内皮细胞
- CREG活化ILK/VEGF促进内皮细胞血管新生
- 2012年
- 目的:探讨E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated gene,CREG)对血管内皮细胞血管新生的影响及其机制。方法:将重组腺病毒CREG载体(Ad-GFP-CREG)和腺病毒GFP载体(Ad-GFP)转染人血管内皮细胞株(vascularendothelialcell,VE),转染后细胞分别命名为ADCREG和ADGFP。内皮细胞基质胶血管形成实验观察其比较3组细胞血管发生情况。应用Western blotting测定细胞中CREG、整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)的表达。应用ILK激酶活性突变的质粒转染和不同浓度的VEGF中和抗体转染VE后进行细胞血管形成能力检测。结果:体内基质胶血管形成实验显示,腺病毒介导的CREG过表达显著促进VE的血管形成能力,血管密度、数量和交叉点均较对照组ADGFP和VE显著增多(P<0.01)。同时,Westernblot分析证实CREG过表达显著增加了ILK与VEGF的表达;转染ILK激酶失活质粒导致ADCREG成血管能力显著减弱(P<0.001)。应用VEGF中和抗体干预后,ADCREG细胞的成血管能力也呈现剂量依赖性下降。并且ILK激酶活性受到抑制的ADCREG细胞中VEGF表达降低。结论:CREG基因过表达通过活化ILK/VEGF信号通路促进了内皮细胞血管新生。
- 闫承慧孙鸣宇张剑田孝祥陶杰张效林韩雅玲
- 关键词：平滑肌细胞
