国家自然科学基金(31201877)
- 作品数：11 被引量：17H指数：2
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- 猪瘟病毒 E2蛋白的原核表达及鉴定被引量：1
- 2014年
- 以猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白为研究对象,通过扩增CSFV C株E2基因,亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建重组原核表达质粒pGEX-6P-1-E2,转化至宿主菌Rostta(DE3)后进行诱导表达。SDSPAGE检测表明与目的蛋白大小一致,其分子质量大小为67.0ku,并且目的蛋白以包涵体形式存在。Western blot表明,重组蛋白能与CSFV兔化高免血清反应并且能被GST标签单抗所识别,表明该融合蛋白正确表达,具有良好的抗原性,为CSFV抗体检测试剂盒的研究奠定了基础。
- 朱艳平郭东光岳锋李鹏尹创成银梅王选年
- 关键词：猪瘟病毒E2蛋白原核表达
- 猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及优化被引量：7
- 2016年
- 以原核表达、纯化的猪瘟病毒(CSFV)E2主要抗原区蛋白为目标检测物,通过对各反应条件的筛选和优化,建立了检测CSFV抗体的间接ELISA检测方法。结果表明,本研究的最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度分别为1.0μg/mL和1∶200;最佳抗原包被条件和最佳封闭时间均为37℃1h;最佳酶标二抗稀释度和作用时间分别为1∶10 000和37℃45min;阴性临界值判断标准为当D450nm<0.30时猪血清样品为CSFV抗体阴性;批内和批间重复试验变异系数分别为4.8%和6.9%,表明该检测方法具有较高的稳定性;特异性试验结果表明,间接ELISA方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)阳性血清均无交叉反应;应用该间接ELISA方法随机检测80份猪血清样品,与进口阻断ELISA试剂盒相比其阳性符合率为83.58%,阴性符合率为76.92%,总体符合率为80.25%。结果表明本试验建立的间接ELISA方法具有很好的临床应用价值。
- 冯春花朱艳平郭东光岳锋
- 关键词：猪瘟病毒E2蛋白间接ELISA抗体检测
- 猪PD-1胞外区基因的克隆及原核表达
- 2015年
- 为研究PD-1/PD-L1通路在猪免疫抑制性疾病中的作用,根据猪的PD-1的基因序列,设计扩增其胞外区的引物,从猪PBMC基因组中通过PCR扩增获得猪PD-1胞外区基因片段,测序正确后克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组原核表达质粒pET32-PD1,转化大肠埃希菌DH5α。挑选可疑菌落鉴定正确后转至Rosetta(DE3)进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果表明,在37℃、0.5mmol/L IPTG条件下诱导获得33ku的PD-1胞外区融合蛋白,能够被其多抗血清、His标签抗体和人PD-1抗体所识别。本研究为制备其单克隆抗体和研究PD-1/PD-L1在猪免疫抑制性疾病中的作用提供了材料。
- 杨媛朱艳平岳锋孙国鹏张艳芳银梅王选年
- 关键词：胞外区克隆原核表达
- 猪瘟病毒在猪体组织中的分布被引量：1
- 2018年
- 建立一种猪瘟病毒TaqMan qPCR检测方法,为研究急性死亡期猪瘟病毒在组织中的分布提供一种可靠的方法。采用病理变化和实验室诊断方法对河南新乡某种猪场送检的病死猪进行诊断。根据猪瘟病毒特异性靶基因E0,设计并合成1对引物和水解探针,建立了TaqMan qPCR方法。以不同浓度的重组质粒pMD19-T-E0为模板,生成标准曲线,并对其重复性和特异性进行了验证,并用建立的方法对该病死猪的内脏组织进行检测,分析猪瘟病毒在体内组织中的差异性。利用建立的猪瘟病毒TaqMan qPCR检测方法,从PPV、PCV和PEDV等基因组的cDNA/DNA中不能扩增出目的条带;对3个不同的浓度梯度的重组质粒进行检测,其批间、批内的变异系数均小于2%,表明该方法的特异性和重复性较好。对猪瘟内脏组织病料进行检测发现,其猪瘟病毒主要集中在淋巴结、脾脏、肠道组织、血液及心脏等组织中,不同组织器官中的病毒载量也存在着一定的差异。该研究对疑似感染猪瘟病毒急性死亡的病猪进行了鉴别诊断,同时用建立的TaqMan qPCR方法检测了猪瘟病毒在组织中分布的差异性,为猪瘟的科学防控及发病机制的研究奠定了基础。
- 张秋雨李鹏陈晴任鹏举银梅王选年
- 关键词：猪瘟病毒E0基因TAQ
- 猪瘟病毒NS2-3抗原集中区基因的原核表达及鉴定
- 2013年
- 为获得猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)NS2-3抗原集中区蛋白,并建立CSFV抗体快速检测方法。本研究以CSFV全长基因组质粒为模板,PCR扩增NS2-3抗原表位集中区,利用扩增片段和克隆载体,构建重组表达质粒,命名为pET32a-NS2-3-1。重组表达质粒转化Rosetta(DE3)细胞,利用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定重组表达产物。结果表明,重组质粒pET32a-NS2-3-1在28℃诱导5h得到高效表达,重组蛋白能够与兔抗CSFV阳性血清发生反应。获得CSFVNS2-3抗原集中区蛋白,并且获得的重组蛋白具有抗原性,能够作为CSFV抗体检测的抗原。
- 刘卫朱艳平宁红梅银梅郭东光鲁毅王选年
- 关键词：猪瘟病毒抗原表位原核表达免疫印迹
- 猪瘟病毒E2蛋白配体表位的筛选与鉴定
- 2019年
- 为进一步精确定位猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白配体表位信息,利用DNASIS(Ver.2.5)软件分析设计合成7条多肽,主要覆盖E2蛋白,分别命名为SE21、SE22、SE231、SE232、SE241、SE242、SE03,同时设计合成1条无关多肽CP,均标记FITC。将PK-15细胞作为靶细胞,通过多肽与PK-15细胞结合试验、多肽抑制CSFV感染PK-15细胞试验和CSFV阻断多肽与PK-15细胞结合试验,筛选和鉴定E2蛋白配体表位。结果表明,多肽SE241、SE242与PK-15细胞结合的平均荧光强度分别为74.43±4.59和83.60±3.11,显著高于其他多肽,抑制CSFV感染PK-15细胞的感染抑制率也显著高于其他多肽,同时这2条多肽与PK-15细胞的结合被CSFV有效阻断。证实SE241、SE242多肽为CSFV与靶细胞PK-15细胞结合的配体表位,并能抑制CSFV感染PK-15细胞。本试验为CSFV新型多肽疫苗或免疫佐剂的研制提供依据。
- 银梅李鹏岳锋张秋雨胡东方宁红梅孔令芸姜金庆王选年
- 关键词：猪瘟病毒E2蛋白
- 猪瘟病毒E2蛋白抗原表位集中区的原核表达及鉴定被引量：2
- 2013年
- 为获得猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白抗原表位集中区原核重组目的蛋白,建立CSFV抗原和抗体快速检测方法。通过扩增CSFV E2蛋白抗原表位集中区基因,亚克隆至表达载pET-30a(+),构建重组原核表达载体pET-30a-E2-1,转化至宿主菌Rostta(DE3)后进行诱导表达。SDS-PAGE分析显示,出现与目的蛋白大小一致的蛋白条带,分子质量大小为31ku。对重组蛋白表达条件进行优化,最终获得其诱导表达的最佳温度为18℃,最佳IPTG浓度为0.1mmol/L。目的蛋白以包涵体形式存在,其表达量约占菌体总蛋白含量的46%。Western blot分析显示,目的蛋白不仅能与兔抗CSFV高免血清反应,还可以与载体特异性标签His单抗反应,表明融合蛋白具有良好的抗原性,为CSFV抗原和抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。
- 郭东光朱艳平银梅宁红梅潘耀谦刘卫陈明艳王选年
- 关键词：猪瘟病毒E2蛋白抗原表位原核表达
- 鸡传染性支气管炎病毒S1基因抗原区的原核表达及鉴定被引量：2
- 2014年
- 本研究以鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)S1基因为研究对象,设计特异性引物扩增S1抗原集中区目的基因,长度为198bp,亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建重组原核表达质粒pGEX-6P-1-S1,转化至宿主菌Rosetta(DE3)后进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,表达获得1条特异性蛋白条带,其分子质量大小为33.0ku,与预期蛋白大小一致。可溶性分析结果表明目的蛋白以包涵体形式存在。Western blotting结果显示,重组蛋白能与IBV鸡阳性高免血清反应,被GST标签单抗识别,结果表明该融合蛋白正确表达并具有良好的抗原性。本研究为制备IBV单克隆抗体奠定了抗原基础。
- 朱艳平郭东光岳锋杨媛李冲王爱国李博文阮涛孔令芸王选年
- 关键词：鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白原核表达
- 结构蛋白VP4、VP6和VP7对牛轮状病毒的致病作用被引量：1
- 2018年
- 牛轮状病毒是引发犊牛严重腹泻的重要病原体,其结构蛋白VP4、VP6与VP7三者的相互作用对病毒的组装与感染发挥着至关重要的作用。在病毒感染过程中,VP4可以影响VP7的抗原性,而VP7通过反向调节VP4又可以影响病毒体对宿主细胞的特异性吸附作用,此外,三者在结构上的特异性分布,不仅可以构成病毒框架和稳定VP4、VP7的空间结构,而且可以增强它们的免疫原性。所以,对结构蛋白VP4、VP6和VP7在结构上和生物学特性上的认识,对于今后在治疗和预防轮状病毒性疾病具有非常重要的生物学意义。
- 冯春花郭东光郭东光
- 关键词：轮状病毒
- 新乡市某猪场猪瘟病毒的鉴别检测被引量：4
- 2015年
- 新乡市某猪场发生疑似猪瘟病例,为了鉴别其为疫苗毒还是野毒,采用细胞免疫化学方法和RT-PCR,并对其NS5B基因进行序列测定,序列比对并构建进化树,结果表明,猪只为猪瘟野毒感染,且分离的猪瘟病毒与石门(Shimen)株在基因序列上未发生大的变异。
- 孔令芸陈玲丽李冲孙相和李鹏王选年银梅
- 关键词：猪瘟病毒免疫细胞化学反转录-聚合酶链反应
