国家自然科学基金(30972081)
- 作品数：7 被引量：10H指数：2
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- Loxp序列位置对基因表达的影响被引量：1
- 2018年
- 【目的】先选用绿色荧光蛋白基因(egfp)作为试验基因构建loxp位点位于egfp基因上游或下游不同位置的表达结构,对loxp位点的位置对基因表达的影响进行初步分析。然后以植酸酶(phytase)基因为另一个试验基因对通过egfp基因得出的结果进行进一步验证。研究结果为开展通过基因打靶技术将外源基因与内源基因通过2A序列连接共表达的转基因动物制作中,打靶位点的选择提供可靠依据。【方法】先选择增强绿色荧光蛋白基因(egfp)为试验基因,红色荧光蛋白基因(dsred2)为内参基因。以p EGFP-N2、p GEM-5zf-loxp质粒为基础,构建了ploxp-EGFP(loxp序列位于egfp基因开放阅读框的Kozak序列上游的5′非翻译区)、p EGFP-loxp(loxp序列位于egfp基因开放阅读框的终止密码子下游的3′非翻译区)、ploxp-EGFP-loxp(egfp基因开放阅读框的Kozak序列上游5′非翻译区和终止密码子下游3′非翻译区各有一个loxp序列)。以p EGFP-N2质粒为对照质粒,以p Ds Red2-N1为内参质粒,与所构建的egfp基因各表达质粒共转染PK15细胞,转染24h后在荧光显微镜下观察荧光表达情况,用荧光分析软件Image J进行荧光强度分析并记录荧光强度,进而应用SPSS19.0软件对各转染荧光表达情况进行分析,确定loxp序列的位置对基因表达的影响。为了对以egfp基因为试验基因所得到的结果进行进一步验证,本试验选择植酸酶(phytase基因)基因为试验基因,egfp基因为转染内参基因萤火虫荧光素酶基因(luciferase基因)为表达内参基因。以p IREs NEo、p GEM-5zf-loxp和p T-phytase、p GL4.13[luc2/SV40]质粒为基础。构建了p-SV40-luciferase-CMV-loxp-phytase(loxp序列位于phytase基因开放阅读框的Kozak序列上游的5′非翻译区)、p-SV40-luciferase-CMV-loxp-phytase-loxp(phytase基因开放阅读框的Kozak序列上游5′非翻译区和终止密码子下游3′非翻译区各有一个loxp序列)、p-SV40-luciferase-CMV-phytase-lo
- 许盈盈靳伟代敏敏樊宝良
- 关键词：基因表达基因打靶
- RNA聚合酶Ⅱ启动子驱动的长双链RNA干扰载体的构建与验证被引量：1
- 2013年
- 为了探索构建由RNA聚合酶Ⅱ型启动子驱动、能有效避免干扰素反应的表达长双链RNA的RNA干扰载体,试验在转录单元两端各添加了一个自剪切核酶序列,在转录后切成RNA出核所必要的5'帽子和3'polyA尾,以绿色荧光蛋白(EGFP)基因为报告基因插入2个核酶之间作为试验载体,以表达红色荧光蛋白基因的载体作转染效率校准,通过瞬间转染对荧光蛋白的表达情况进行观察和RT-PCR分析。结果表明:在转染效率基本一致的情况下,试验组未观察到绿色荧光;2个核酶能够完全自剪切,试验组细胞质中有EGFP mRNA的存在,但与正常对照组相比下降了46.1%。说明研究设计的载体达到了延迟表达RNA出核的目的,为用该载体表达长双链RNA时在其出核之前被Dicer酶有效切割成小双链RNA从而避免其出核引起干扰素反应提供了时间保障。
- 曹柯孙朕黄培华樊宝良
- 关键词：RNA干扰核酶
- 牛磺酸合成限速酶基因的克隆及乳腺特异性表达载体的构建被引量：2
- 2013年
- 为了构建提高牛奶中牛磺酸含量的乳腺特异性表达载体,试验采用RT-PCR方法从牛的乳腺组织中扩增出牛磺酸合成限速酶——半胱亚磺酸脱羧酶(CSAD)cDNA,克隆至pMD-19T载体,测序正确后通过XhoⅠ酶切连接到乳腺特异性表达载体pBLG上,再进行测序比对及酶切鉴定。结果表明:所构建的载体与预期完全相符。
- 郜富权樊宝良
- 关键词：限速酶牛磺酸
- 太行鸡VIPR-1基因内含子1多态性及其与早期产蛋性状相关性研究被引量：2
- 2020年
- 为了探索鸡血管活性肠肽受体-1(VIPR-1)基因内含子1多态性与太行鸡早期产蛋性能的相关性,及应用这些多态标记对保种群保种效果进行初步评价,试验参考鸡VIPR-1基因内含子1序列设计引物,以260只产蛋记录完整的太行鸡基因组DNA为模板进行PCR扩增,对符合测序要求的PCR扩增产物进行测序,通过分析测序结果寻找多态位点,对多态位点的遗传参数进行分析,进而评价保种效果,同时对不同基因型和单倍体型组合与开产日龄、各周龄产蛋量进行关联分析。结果表明:260份太行鸡血液样品经PCR扩增均获得了大小为651 bp的条带,该条带明亮、特异性良好,能够满足DNA测序需要;在VIPR-1基因内含子1中发现了8个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphic,SNP)位点,分别为SNP1(T37748G)、SNP2(G37813A)、SNP3(G37823A)、SNP4(A37962/-)、SNP5(A37973G)、SNP6(G38013A)、SNP7(C38035G)和SNP8(A38111G);这8个位点均属于中度多态,且均处于Hardy-Weinberg平衡状态,即试验鸡群体未经选择,保种效果良好;SNP4(A37962/-)的各基因型个体间早期产蛋性能存在差异,A0基因型与00基因型在37周产蛋数上显著或极显著高于AA基因型;单倍体型组合为H1H2(TGGAAGCA/GAA-GAGG)的个体早期产蛋数显著高于其他单倍体型组合。说明试验发现了一个与太行鸡早期产蛋显著相关的SNP位点(SNP4)和一个优势单倍体型组合(TGGAAGCA/GAA-GAGG),可作为太行鸡早期产蛋性状的分子标记,用于太行鸡早期产蛋性能的分子标记辅助选择以及保种群保种效果的评价。
- 李德娟许盈盈代敏敏褚素乔郭伟婷樊宝良
- 关键词：多态性产蛋性能保种
- 太行鸡慢羽公鸡羽速基因型鉴定方法的建立与验证被引量：2
- 2019年
- 快慢羽性状为伴性遗传性状,可通过建立雌雄自鉴别品系应用于家禽的早期性别鉴定。因慢羽基因对快羽基因呈显性,故区分慢羽公鸡的羽速基因型是建立慢羽纯系的重要工作。使用传统测交鉴定方法鉴别耗时费力,而已有的分子鉴定方法有的成本太高,有的准确率太低。本研究以已有表型记录的快羽或慢羽太行鸡公母鸡为试验材料,设计了半定量PCR鉴定公鸡慢羽羽速基因型引物,通过摸索最佳反应体系和条件并通过对测交验证,最终建立了能较准确鉴定太行鸡慢羽公鸡羽速基因型方法,为太行鸡慢羽纯系的建立奠定技术基础。
- 靳伟代敏敏樊宝良
- 关键词：慢羽基因型
