广东省自然科学基金(S2012010010181)
- 作品数：13 被引量：61H指数：4
- 相关作者：张雅洁王红艳龙捷李书华黄榕权更多>>
- 相关机构：广州医科大学广州市第一人民医院梅州市人民医院更多>>
- 发文基金：广东省自然科学基金国家教育部博士点基金广州市教育系统创新学术团队项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- CD133阳性/阴性肺癌细胞的分选、鉴定及差异基因的筛选被引量：6
- 2015年
- 背景与目的研究表明多种实体肿瘤中存在肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs),肿瘤干细胞与非肿瘤干细胞的生物学特性存在已有的明显差异,而CD133被认为是肿瘤干细胞的标记物,因此CD133阳性细胞与CD133阴性细胞可能存在明显差异。本研究通过分选人肺腺癌A549细胞中的CD133阳性及CD133阴性细胞,鉴定两组细胞的生物学特性并在人组织标本进行验证,利用基因芯片筛选转移相关差异基因。方法采用磁式分选(magnetic activated cell sorting,MACS)的方法对人肺腺癌A549中CD133阳性细胞、CD133阴性细胞进行分选,通过无血清条件培养、平板克隆、血清诱导分化及基因芯片等实验,比较两组细胞"sphere"形成、细胞增殖、细胞分化以及差异基因,并在人组织标本进行CD133表达与临床特性的验证分析。结果 CD133阳性细胞能在无血清培养基中悬浮生长并形成"sphere";其平均克隆形成率(57.1%)明显高于CD133阴性细胞(3.3%);CD133阳性细胞能被血清诱导分化、表达腺癌标志物CK7;两组细胞中的19个转移基因表达水平相差两倍或以上,差异最高达12倍;肺癌组织中CD133阳性细胞主要分布于癌巢周边,数量稀少,其表达与肿瘤组织学分型、分级及临床分期无关。结论 CD133阳性肺腺癌A549细胞具有CSCs特性;两组细胞在转移相关基因的表达存在明显差异,其中CD82可能在CD133阳性细胞的转移机制中起重要作用。
- 郑少秋李书华王红艳谢晓斌张雅洁
- 关键词：CD133转移相关基因
- 短肽RGDSY-CTTHWGFTLC对乳腺癌细胞转移和增殖的影响被引量：2
- 2013年
- 目的研究短肽RGDSY-CTTHWGFTLC对乳腺癌MCF-7细胞的抗肿瘤能力,为开发更高效的肽类抗肿瘤药物奠定实验理论基础。方法 (1)化学合成目标短肽RGDSY-CTTHWGFTLC(简称RGDSY-CTT),阳性对照肽CTTHWGFTLC(简称CTT),阴性对照肽STTHWGFTLS(简称STT);(2)将MCF-7细胞接种于预涂布纤连蛋白的96孔板,与短肽共孵育2 h,检测RGDSY-CTT对MCF-7细胞粘附能力的影响;(3)将MCF-7细胞接种于预铺基质胶的Transwell小室,与短肽共孵育16 h,检测RGDSY-CTT对MCF-7细胞侵袭能力的影响;(4)与短肽共孵育12 h后,MTT法检测RGDSY-CTT对MCF-7细胞增殖能力的影响;(5)与短肽共孵育24 h后,PI染色流式法检测RGDSY-CTT对MCF-7细胞凋亡和细胞周期的影响。结果(1)短肽对MCF-7细胞粘附能力的影响:RGDSY-CTT在终浓度为50、100、200μg/ml时,MCF-7细胞的粘附率依次为85.1%、74.1%和63.8%,随着浓度升高,粘附率明显降低,且比CTT组下降更显著(P<0.05);(2)短肽对MCF-7细胞侵袭能力的影响:RGDSY-CTT在终浓度为100、200μg/ml时,对MCF-7细胞的侵袭抑制率分别为41.8%和63.9%;两个浓度均有明显抑制(P<0.01);但与CTT组比抑制无显著差异(P>0.05);(3)短肽对MCF-7细胞增殖的影响:RGDSY-CTT在终浓度为50、100、200μg/ml时,MCF-7细胞的增殖率依次为98.8%、82.4%和63.0%,随着肽浓度升高,增殖率下降明显;在100、200μg/ml时增殖抑制能力比CTT更强(P<0.05);(4)短肽对MCF-7细胞凋亡和细胞周期的影响:RGDSY-CTT处理组MCF-7细胞经流式法检测到凋亡峰,细胞周期阻滞发生在G0/G1期,占76.7%,显著高于CTT组、STT组及正常对照组(P<0.01)。结论 RGDSY-CTT能抑制乳腺癌细胞的侵袭能力,同时还具有抑制乳腺癌细胞粘附、增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的能力。
- 黄榕权龙捷张惠球张雅洁
- 关键词：短肽RGD乳腺癌
- 重组腺病毒载体pDC316-hIL--24的构建及病毒滴度测定被引量：2
- 2014年
- 目的构建重组腺病毒载体pDC316-hIL-24,并测定病毒滴度。方法从HEK293细胞中提取mRNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增hIL-24基因全编码区序列。将测序正确的片段用BglⅡ和HindⅢ双酶切定向插入到pDC316-EGFP穿梭质粒中。构建重组穿梭质粒pDC316-EGFP-hIL-24,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC316-hIL-24,经HEK293细胞扩增,TCID50法测定重组腺病毒滴度。结果成功构建出表达h IL-24基因的重组腺病毒载体(pDC316-hIL-24),获得了高滴度表达hIL-24基因的重组腺病毒。结论重组腺病毒表达载体(pDC315-hIL-24)的成功构建及重组腺病毒的获得有利于进一步开展肿瘤的转基因治疗研究。
- 李书华陈婷婷刘谕昆李灏陈艺瑛张雅洁
- 关键词：重组腺病毒载体病毒滴度
- 基因芯片筛选CD133^+/CD133^-肺腺癌细胞中新的耐药基因被引量：3
- 2014年
- 背景与目的肿瘤干细胞可能是肿瘤多药耐药的主要原因,CD133是目前较为公认的肿瘤干细胞标记物。本研究旨在应用功能分类基因芯片筛选CD133+和CD133-肺腺癌细胞中差异表达的肿瘤耐药基因,寻求新的肺癌耐药相关基因。方法免疫磁珠分选法分选A549细胞,采用功能分类基因芯片筛选CD133+和CD133-肺腺癌细胞中差异表达的肿瘤耐药基因,并使用RT-qPCR验证。顺铂半数有效抑制浓度(half inhibiting concentration,IC50)、阿霉素IC50作用A549细胞48 h后,RT-qPCR检测肿瘤耐药基因CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、GSK3α、PPARα和PPARβ/δ的表达变化。结果共筛查出31个差异表达的肿瘤耐药基因,与CD133-细胞相比,CD133+细胞有30个基因表达上调,1个基因表达下调。RT-qPCR结果与芯片一致。A549细胞经1.97μg/mL顺铂或0.61μg/mL阿霉素作用48 h后,CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、GSK3α、PPARα和PPARβ/δ等肿瘤耐药基因表达上调。结论利用功能分类基因芯片筛选出31个可能与CD133+肺腺癌细胞耐药相关的基因,其中CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、GSK3α、PPARα和PPARβ/δ为新发现的肺癌耐药相关基因。
- 王红艳郑少秋涂永生张雅洁
- 关键词：CD133耐药
- 乳腺癌MMP-2、MMP-9的体外阻断研究被引量：7
- 2014年
- 目的:探讨乳腺癌MMP-2、MMP-9表达的临床病理联系及直接阻断MMP-2、MMP-9对乳腺癌细胞增殖、侵袭及细胞周期的影响。方法:应用免疫组织化学方法检测48例乳腺癌MMP-2、MMP-9的表达。明胶酶谱法检测乳腺癌MCF-7细胞MMP-2、MMP-9的表达。MCF-7细胞接种于预铺BME的Transwell小室上室,与MMP-2、MMP-9的阻断剂CTT共孵育16h,观察阻断MMP-2、MMP-9对MCF-7细胞侵袭能力的影响。MCF-7细胞与CTT共孵育12h后,MTT法检测阻断MMP-2、MMP-9对细胞增殖能力的影响。MCF-7细胞与CTT共孵育24h后,PI染色流式法检测阻断MMP-2、MMP-9对细胞凋亡和细胞周期的影响。结果:48例乳腺癌组织有MMP-2表达者45例(93.75%),MMP-9表达者38例(79.17%),MMP-2和MMP-9在发生淋巴结转移组明显高表达(P<0.05);组织学分级越高,MMP-2和MMP-9的表达越显著(P<0.05)。明胶酶谱法检测:在MCF-7培养上清中检测到MMP-2、MMP-9的表达。在浓度为100μg/ml和200μg/ml时CTT对MCF-7细胞的侵袭抑制率达到39.5%和61.9%。在终浓度为50、100、200μg/ml时,CTT对MCF-7细胞的增殖率均无明显下降(P>0.05)。CTT处理组MCF-7细胞经流式法检测未见凋亡峰,细胞周期各期未见明显阻滞(P>0.05)。结论:MMP-2、MMP-9与乳腺癌的淋巴结转移密切相关,阻断MMP-2、MMP-9可有效抑制乳腺癌的浸润和转移。
- 黄榕权谢燕清张雅洁
- 关键词：乳腺癌基质金属蛋白酶免疫组织化学明胶酶谱
- CXCR4启动子的条件复制型腺病毒对肺癌细胞的靶向杀伤作用
- 2015年
- 目的:构建CXCR4启动子的条件复制型腺病毒载体CRAd-CXCR4-GFP,探究CRAd-CXCR4-GFP对肺癌细胞的靶向杀伤效应。方法:PCR法扩增人CXCR4-E1A基因并克隆至穿梭质粒p DC316-GFP,将骨架质粒p BHG-lox-E1,3Cre和重组质粒p DC316-CXCR4-GFP共转染293细胞,产生重组腺病毒CRAd-CXCR4-GFP并扩增,扩增后进行PCR鉴定和腺病毒滴度测定;real-time PCR检测5种肺癌细胞株CXCR4的mRNA表达,筛选出表达最高的A549细胞;将CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分别转染A549细胞,检测两者转染后CXCR4启动子活性和腺病毒复制数;将CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分别转染A549细胞和16HBE细胞,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,CCK-8检测各组细胞活性。结果:成功构建重组质粒p DC316-CXCR4-GFP,与骨架质粒p BHG-lox-E1,3Cre共转染293细胞后第11天可见片状绿色荧光;PCR表明目的基因CXCR4-E1A已成功整合在重组腺病毒基因组中;测定重组腺病毒滴度为1×1013PFU/L;CRAd-CXCR4-GFP转染A549细胞后E1A的mRNA和E4表达较Ad-NULL组明显上升;与Ad-NULL组和空白对照组相比,CRAd-CXCR4-GFP组前4 d A549细胞凋亡率和活性无明显差异,第5天细胞凋亡率明显增加,细胞活性明显降低,各组间5 d内16HBE细胞的细胞凋亡率和细胞活性均无明显变化。结论:成功构建条件复制型腺病毒表达载体CRAd-CXCR4-GFP,该载体对肺癌细胞具有靶向杀伤作用。
- 李龙光李书华王红艳龙捷谢晓斌张雅洁
- MDA-7基因的腺病毒载体构建及对肺腺癌A549细胞凋亡的影响被引量：3
- 2014年
- 目的构建一种由腺病毒AdMax包装系统表达目的基因——黑色素瘤分化相关基因-7(MDA-7)的复制缺陷型腺病毒,并初步探索其抗肿瘤活性。方法通过基因操作技术将目的基因(MDA-7)插入到5型腺病毒AdMax包装系统的E1A区域,构建复制缺陷型腺病毒Ad.hMDA-7-EGFP;同时构建对照病毒Ad.EGFP。病毒滴度计算按寇化法(Karber法)进行腺病毒感染性滴度(TCID50)测定。应用免疫组化染色法检测MDA-7在感染2种病毒的肺腺癌A549细胞中的表达状态;通过二苯甲亚胺-碘化丙啶(Hoechst33342-PI)双染色法及流式细胞仪检测2种病毒对肿瘤细胞杀伤的差异。结果成功构建携带目的基因的腺病毒载体,经聚合酶链反应(PCR)鉴定正确;MDA-7在感染Ad.hMDA-7-EGFP的肺腺癌A549细胞中表达,以相同感染复数(MOI)值感染Ad.EGFP时肺腺癌A549细胞中未检测到MDA-7表达;Ad.hMDA-7-EGFP对肿瘤细胞株杀伤能力明显高于Ad.EGFP。结论成功构建复制缺陷型腺病毒Ad.hMDA-7-EGFP,并证实MDA-7蛋白在肿瘤细胞中过表达,诱导肺腺癌A549细胞株发生凋亡。
- 李书华龙捷王红艳谢晓斌张雅洁
- 关键词：病毒复制基因疗法复制缺陷型腺病毒
- 肺癌转移相关microRNA miR-29b的生物信息学分析被引量：4
- 2014年
- 目的:应用生物信息学分析A549细胞中在CD133阳性低表达的miR-29b的靶基因及其功能,为以miR-29b为靶点的肿瘤研究提供线索。方法:利用miRNA PCR芯片筛选A549细胞中CD133阳性和CD133阴性差异表达的miRNA,选用miRecords预测miR-29b的靶基因,合并已证实的靶基因,利用GOEAST和DAVID数据库对所得靶基因进行功能富集分析和信号转导通路富集分析。结果:A549细胞中与CD133阴性比较,miR-29b在CD133阳性中表达下调。miR-29b靶基因有106个,其靶基因功能富集于结合和细胞外基质形成等作用(P<0.01);信号转导通路显著富集于JAK-STAT和TGF-β等信号转导通路(P<0.05)。结论:miR-29b可能与肺癌转移相关,miR-29b的靶基因显著富集在与肿瘤相关的信号通路中。
- 王红艳郑少秋涂永生张雅洁
- 关键词：肺癌靶基因生物信息学
- 双靶点抗肿瘤肽RGDSY-CTTHWGFTLC的设计合成及活性研究
- 2014年
- 目的设计合成CTTHWGFTLC(简称CTT)的衍生肽RGDSY-CTTHWGFTLC(简称RGDSY-CTT),以期获得更优的水溶性、活性和抗肿瘤能力。方法 (1)自行设计RGDSY-CTT肽,化学合成(公司合成),并合成CTT(阳性对照)、STT(即STTHWGFTLS,阴性对照),质谱分析。(2)将Ⅳ型胶原酶、酶底物酪蛋白分别与RGDSY-CTT、CTT共孵育,酪蛋白水解抑制实验检测短肽的抑酶活性。(3)取RGDSY-CTT、CTT分别溶于蒸馏水,以蛋白定量BCA法对比两者的溶解度。(4)MCF-7细胞接种于预涂布纤连蛋白的96孔板,分别与RGDSY-CTT、CTT、STT共孵育,细胞黏附试验比较短肽对MCF-7细胞黏附能力的影响。(5)MCF-7细胞接种于Transwell小室的上室,分别与RGDSY-CTT、CTT、STT共孵育,细胞迁移试验比较RGDSY-CTT与CTT对MCF-7细胞迁移能力的影响。结果短肽合成,质谱分析符合。在浓度为250μg/ml时RGDSY-CTT、CTT对Ⅳ型胶原酶的水解抑制率为53.6%和77.7%;在500μg/ml时,两者抑制率分别为94.6%和96.9%。BCA法测得CTT的饱和溶解度约为745μg/ml,而RGDSY-CTT最高检测值为4 030μg/ml,溶液并未饱和。RGDSY-CTT在终浓度为50、100、200μg/ml时,MCF-7细胞的黏附率依次降低为:85.1%、74.1%、63.8%,黏附率显著低于CTT处理组(P<0.01)。在100和200μg/ml浓度时,RGDSY-CTT对MCF-7细胞的迁移抑制率为42.9%和60.8%;两个浓度RGDSY-CTT的抑制作用均比CTT强(P<0.05)。结论新合成短肽RGDSY-CTT的水溶性较CTT明显改善。RGDSY-CTT获得了抑制肿瘤细胞黏附的能力,并具有比CTT更强的运动抑制能力。
- 黄榕权龙捷张雅洁
- 关键词：短肽RGD乳腺癌
- 可活化细胞穿膜肽的设计及修饰高分子载体pHPMA的作用检测
- 2014年
- 目的合成一种可活化细胞穿膜肽ACPP,并初步探索其穿膜活性及其对高分子聚合物pHPMA的共价修饰作用。方法通过化学合成的方法合成可活化细胞穿膜肽ACPP,通过免疫荧光法检测细胞内mmp2蛋白的表达;通过荧光显微镜观察鉴定ACPP的穿膜活性。通过化学修饰法合成接合物pc-Ad.egfp及ACPP-pc-Ad.egfp。通过荧光显微镜观察及动态光散射法初步鉴定接合物的合成,通过荧光显微镜观察鉴定接合物ACPP-pc-Ad.egfp亚细胞分布。结果成功合成了可活化细胞穿膜肽ACPP;ACPP具有肿瘤靶向性穿膜活性;通过ACPP修饰高分子聚合物pHPMA合成了ACPP-pc-Ad.egfp;经荧光显微镜观察证实ACPP-pc-Ad.egfp具有较强的感染细胞的能力,并由ACPP介导大分子进行非内吞性跨膜运输。结论成功合成了ACPP,ACPP具有肿瘤靶向性穿膜活性,并成功修饰高分子聚合物pHPMA。
- 李书华罗颖洁王俊蔡君香许泽鹏陈艺瑛张雅洁
- 关键词：肿瘤靶向共价修饰
